侵袭性真菌感染的流行现状及快速分子检测技术

小林

随着抗生素、化疗药物的发展和应用，以及艾滋病的肆虐、免疫抑制剂的使用等多因素影响，真菌感染性疾病日益增多。近20年来，侵袭性真菌感染发病率有明显上升的趋势。
1 流行状况
      在美国，1990年住院患者深部真菌感染率是1980年的1.9倍，居各种病原体感染率上升之首位，2004年报道住院患者侵袭性真菌感染率是20世纪90年代的2.4倍，病死率为29%;在欧洲，1983~1997年间，侵袭性真菌感染死亡患者占所有死亡患者的5.1%，而1998一2002年间由侵袭性真菌感染导致死亡的患者占到了7.8%;而在我国，北京协和医院1998年6月-1999年6月调查ICU282例患者中有53例发生深部真菌感染，感染率为18.8%，比1993年的5.6%上升了3.4倍。
      侵袭性真菌感染多发生在医院内，主要由念珠菌、曲霉菌和隐球菌所致。其中，念珠菌仍是血液系统感染的主要致病菌，由其导致的败血症病死率最高。念珠菌感染中以白色念珠菌、热带念珠菌感染多见，但是近年来随着新一代抗真菌药物的应用，光滑念珠菌和克柔念珠菌感染患者增多，并出现耐药。曲霉菌是继念珠菌之后第二常见的真菌病原体，近年来肝、肺、心
脏移植患者的曲霉菌感染发生率高达30%，病死率达60%一0%。隐球菌的主要致病类型是新型隐球菌，隐球菌感染是艾滋病常见的并发症，发生隐球菌脑膜炎后治愈率极低。
      同时一些少见的霉菌、双向真菌及条件致病真菌引起的感染逐渐增多，有研究显示，自氟康唑被广泛地用于防治免疫缺陷患者的侵袭性真菌感染以来，全球白色念珠菌血症的发病率持续下降，而其他非白色念珠菌感染相应增多，其中光滑念珠菌成为新兴的重要条件致病菌。但是流行病学的改变不仅是病原菌的种类发生了变化，随着新型抗真菌药物的相继出现和应用，真菌的耐药性也发生了变化。Sar等利用Etest法检测402株新生隐球菌对氟康哩的敏感性，2年间对氟康唑耐受的菌株增加了1.5%。台湾地区1999年的调查研究显示该地区有12%的近平滑假丝酵母菌和15%的热带假丝酵母菌对氟康唑耐药。2003年台湾地区新型隐球菌对其一线抗菌药物氟康唑和两性霉素B的敏感性降低，有4%的新型隐球菌对氟康唑耐药。
      侵袭性的真菌感染主要发生于粒细胞减少者，长期应用免疫抑制剂治疗的患者，HIV感染的患者，患有血液肿瘤、实体肿瘤的患者。有肺部疾病的患者也比较容易发生系统性真菌感染，因病原真菌常先从肺部人侵;此外，在外科、烧伤科及重症监护(ICU)病房的患者也比较容易催患系统性真菌病;插管等并发的系统性真菌感染的情况亦在不断增加，并且其发病率呈逐年上升的趋势。
2 实验室诊断现状
      快速的诊断鉴定是降低真菌感染病死率的有效途径。然而，全球真菌感染率的上升速度远远超过了实验室真菌学检验的发展速度。现有的真菌感染的实验室检查方法包括常规检查法和特殊检查法两类，常规检查法主要包括:①形态学检查;②培养;③组织病理学检查。特殊检查主要包括:①血清学方法;②分子生物学方法。普通的形态学检查方法敏感度较低，培养法完成真菌菌种的鉴定通常要花费几天甚至几周的时间，血清学检查存在的问题是很难排除真菌某属的种间抗原抗体交叉反应。随着分子生物学技术的发展，已有聚合酶链反应(PCR)、单链构象多态性分析(SCP)、随机扩增DNA多态性(RAPD)、DNA测序、基因芯片等方法用于深部真菌病的快速诊断和分型研究，形成了以PCR技术为基础的一系列分子诊断方法。分子诊断技术具有操作简便、省时、特异性、敏感性高的优点，应用于真菌病的快速诊断、菌种鉴定甚至耐药性检测都是一种较为理想的方法。
      确定真菌感染常以真菌保守序列作为目的基因，现有的针对真菌感染检测的基因序列多取自核糖体蛋白基因(rDNA)及其转录间隔区(ITS)。对于真菌的菌种鉴定首先需要找到种属间的高变区或特异性基因。将PCR方法用于真菌菌种鉴定，研究最多的为念珠菌和曲霉菌，Jaeger曾在18sRNA基因部位设计种特异性引物对念珠菌、曲霉菌、梭霉菌进行了鉴定;美国Henry应用特异性引物将3种主要的致病性曲霉菌:烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌鉴定到种;Sophie Latouche等研究了卡氏肺孢菌的ssrRNA、线粒体rRNA大亚基基因、胸腺嗜吮合酶基因以及rRNA基因的转录间隔区ITS1、ITS2，发现胸腺嘧啶合酶基因用来鉴别来自不同宿主的卡氏肺孢菌具有较好的稳定性。
3 分子诊断技术
      在以上研究的基础上，已有以下几种分子生物技术应用于真菌的快速检测及菌种鉴定。
      3.1  PCR: PCR技术可以对两段已知序列间的DNA进行体外扩增，其原理不再赘述。该方法的关键是根据目的基因设计合适的引物。
      将PCR方法改良后用于真菌感染快速诊断已早有先例。Younes maaroufi 等将TaqMan荧光探针技术用于检测临床血样中的白色念珠菌，显示出很高的敏感性，重现性达96%。但是由于选择扩增的片断是一段高度保守的DNA序列(rRNA 5.8S编码序列)，因此没能同步完成菌种的鉴定。如果用复合PcR的方法同时扩增多个特异的DNA片段，就可以弥补上述不足。然而，现有的复合PCR方法只是简单的将多种目的基因的特异性扩增引物进行混合，在同一体系中反应从而达到多重PCR的目的。这些方法存在的问题:①需要严格的PCR反应条件，例如各种反应成分的浓度、反应成分之间的比例、PCR扩增的温度、时间等;②引物二聚体的形成;③由于引物的选择必须保证它们之间不会形成引物二聚体，这将大大降低多种引物组合进行多重PcR的可能性。
      一种新型的PCR方法是把现有复合扩增方法中的由多对特异引物同时扩增多个特异性基因片段，转变成了由一对非特异引物同时扩增多个特异性基因片段，有效弥补了上述不足，极大改进了传统复合PcR方法，使扩增效率大大提高。但目前国内还没有人将这种方法用于院内真菌感染的检测及鉴定，我实验室已有初步研究，但有待进一步的条件优化。
      3.2 单链构象多态性分析(SSCP):SSCP技术常用于检测单个基因的突变，近年来已有人将其用于医学真菌的检测。walsh等采用SSCP技术对扩增自多种医学真菌的195bp的片段进行分析，能够将念珠菌与曲霉菌鉴别开。国内也曾有学者以聚合酶链反应对多种念珠菌进行扩增，而后采用单链构象多态性(SSCP)技术对6种念珠菌的扩增产物进行分析，结果在聚丙烯酰胺凝胶电泳中不同种念珠菌的SSCP图谱呈明显多态性，能够相互区别。应用SSCP技术识别不同念珠菌，可以在24h内得到明确的结果，有利于对临床上念珠菌感染的早期提示，而且该技术在对其所致感染进行流行病学分析或筛选突变株方面更有意义。
      3.3 随机扩增多态性分析(RAPD):应用PAPD方法对致病菌种进行分型及流行病学研究的较多，几乎涉及所有的致病菌种，如外瓶霉、皮肤癣菌、念珠菌、曲霉菌等。RAPD方法不需要抽提大量的DNA模板，可直接检测临床标本，并可同时进行种间鉴定和种内分型，其技术简便，不需预先知道有关基因序列的信息，具有普遍适用性。具有分型率高、分辨力强、简便快速等优点，其技术已广泛用于真菌分型检测。Silva等采用RAPD 方法对可疑都柏林菌株进行分型鉴定。Chowdhary等对热带念球菌进行分型检测，colombo等对皱落念珠菌进行分型检测，达到了很好的效果。
      3.4 DNA序列分析:在医学真菌学中目前应用最多的是对核糖体转录间隔区和几丁质合成酶序列的测定。DNA序列分析对于了解真菌的基因结构、表达及分子进化关系等具有十分重要的意义。
      3.5 基因芯片技术:基因芯片又名DNA芯片、DNA微阵列，目前已广泛用于多种疾病的诊断。对真菌感染来说，只要找到每种真菌的种属特异性DNA序列，就可以将针对该组序列的一系列探针集成在一块硅胶板上。将标记过的待检测致病性真菌DNA与DNA芯片杂交，就可以获得种属特异性图谱，通过对图谱的比较分析就可以完成菌种的鉴定，实现菌种的信息快速、大规模的分析检测。。
      分子生物学技术应用于真菌感染性疾病的诊断，不仅可以快速完成检测，避免错过最佳治疗时机。还可以同步进行菌种的鉴定，指导合理使用抗真菌药物，在真菌的基因分型鉴定方面也有很大的优势，具有非常广阔的应用前景。
                                                                                                                                    本文编辑：范伟伟