不同抗凝剂、不同保存温度和保存时间对降钙素原检测的影响 ...

河东狮

                                                                             中山大学附属中山医院检验医学中心   
                                                徐全中，王伟佳，阚丽娟，严海忠，幕月晶，欧阳能量，黄燕华，张秀明
       摘要：目的　探讨不同抗凝剂、不同保存温度和保存时间对化学发光法检测降钙素原（ＰＣＴ）的影响。方法  采集１３例疑似细菌感染患者血液，分别置于干燥管和含有分离胶、肝素锂、乙二胺四乙酸二钾（ＥＤＴＡ-Ｋ２）的采血管中，分离血清或血浆，采用ＲｏｃｈｅＣｏｂａｓｅ６０１电化学发光免疫分析仪分别在即刻、１２、２４和７２ｈ进行检测，根据检测结果选出最适采血管，再采集９例疑似细菌感染患者血液置于最适采血管中分离血清或血浆分别存放于４、－３０及－７０℃，在不同的时间进行检测。结果　１３例患者标本，不同采血管在分离血清或血浆后即刻检测结果差异不超过１５％，ＥＤＴＡ-Ｋ２抗凝标本室温存放１２、２４和７２ｈ均降解最少，分别为（２.６１±０.５６）％、（３.８６±０.７６）％、（１５.７７±１.６５）％。ＥＤＴＡ-Ｋ２抗凝标本存放于４、－３０及－７０℃，７ｄ后降解不明显。结论　不同抗凝剂对电化学发光法检测ＰＣＴ没有明显差异，为了标本的有效保存和缩短标本检测时间，推荐临床使用ＥＤＴＡ-Ｋ２抗凝的血浆进行电化学发光法ＰＣＴ的检测。
       关键词：降钙素原；抗凝剂；保存时间；保存温度

       降钙素原（ｐｒｏｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ，ＰＣＴ）是无激素活性的降钙素前肽物质，是由１１６个氨基酸组成的相对分子质量为１３０００的糖蛋白。在生理情况下，主要是由甲状腺滤泡细胞产生，其浓度通常＜０.１ｎｇ／ｍＬ。１９９３年，Ａｓｓｉｃｏｔ等首先提出ＰＣＴ可以作为细菌感染的标志物。严重感染患者的ＰＣＴ显著升高，并与感染的严重程度及临床预后密切相关。其在感染后２～４ｈ即可升高，８～２４ｈ就可以升高到峰值，并且其半衰期较长（２０～２４ｈ），近年来ＰＣＴ在提示细菌感染及其感染程度、判断治疗效果、指导抗菌药物治疗等方面发挥了重要的作用。作为临床实验室，对ＰＣＴ检测时选择何种抗凝剂、采血后多长时间进行检测仍然有效和如何有效的保存标本是我们关心的问题，我们对此进行了探讨。
材料和方法
一、材料
       采血管采用ＢＤ公司的真空采血管。肝素锂管批号为１２１３６２２，抗凝剂为７５ＵＳＰＵｎｉｔｓ；乙二胺四乙酸二钾（ＥＤＴＡ-Ｋ２）管批号为１１４６８９７，抗凝剂３.６ｍｇ；分离胶管批号为１１７９９４８；普通干燥管批号为１１６７５９７。ＲｏｃｈｅＣｏｂａｓｅ６０１电化学发光免疫分析仪及其配套试剂、校准品、质控品（试剂批号为１６２１９２；校准品批号为１６２１９２；质控品批号为低值１６１９５３００，高值１６１９５４００）和配套消耗品。
二、方法
       １．ＲｏｃｈｅＣｏｂａｓｅ６０１电化学发光免疫分析仪检测ＰＣＴ的精密度验证　参考美国临床实验室标准化协会（ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＬＳＩ）的ＥＰ１５-Ａ２文件《用户对精密度和准确度性能的核实试验２批准指南》，选用５个不同浓度的标本，每个标本每天重复测定４次，持续５ｄ。计算分析内不精密度为１.０４％，总不精密度为１.２１％。仪器完全满足临床检测需要。
       ２．血液标本的采集　疑似细菌感染的住院患者１３例，其中男７例，女６例，平均年龄４５岁。空腹抽取静脉血分别注入真空干燥管、分离胶管、肝素锂管和ＥＤＴＡ-Ｋ２管中。普通干燥管和分离胶管室温（２０～２５℃）放置３０ｍｉｎ，待血液凝固后１３００×ｇ离心１０ｍｉｎ分离血清，肝素锂管和ＥＤＴＡ-Ｋ２管颠倒混匀后即刻１３００×ｇ离心１０ｍｉｎ分离血浆。分离的血清或血浆各分装若干份于ＥＰ管密封备用。
       ３．分析方法　（１）不同抗凝剂对ＰＣＴ检测结果的影响分析：用ＲｏｃｈｅＣｏｂａｓｅ６０１电化学发光免疫分析仪对１３例分装于真空干燥管、分离胶管、肝素锂管和ＥＤＴＡ-Ｋ２管分离的患者血清或血浆分别在即刻、１２、２４和７２ｈ进行测定；（２）不同保存温度和保存时间对ＰＣＴ检测结果的影响分析：用前一步选出的最适采血管，采集９例疑似细菌感染的住院患者（其中男４例，女５例，平均年龄４１岁）血清或血浆，分别置于４、－３０和－７０℃保存，即刻分离血清或血浆时测定１次，４℃保存的标本分别在１２ｈ、２４ｈ、７２ｈ、７ｄ进行测定，－３０和－７０℃保存的标本分别在２４ｈ、７２ｈ、７ｄ进行测定（－７０℃保存的标本在７ｄ进行检测之前反复冻融２次）。
三、统计学方法
       采用ＳＰＳＳ１７.０软件进行统计学分析，检测结果以±ｓ或平均浓度百分率±百分标准差表示，采用配对资料的ｔ检验，Ｐ＜０.０５为差异有统计学意义。
结　　果
一、血清和不同抗凝剂的血浆检测结果
       比较１３例标本不同采血管的即刻检测结果，差异均不超过１５％。ＥＤＴＡ-Ｋ２是试剂盒推荐的抗凝剂，并且以ＥＤＴＡ-Ｋ２抗凝的血浆ＰＣＴ在７２ｈ内的降解速率最慢，以ＥＤＴＡ-Ｋ２抗凝血浆即刻检测平均浓度作为百分百标准参照，普通干燥管检测平均浓度为１０２.８４％，有＋２.８４％的差异；分离胶管为１１１.４７％，有＋１１.４７％的差异，肝素锂管为９７.２４％，有－２.７６％的差异。
二、血清和不同抗凝剂的血浆在不同放置时间的降解百分率
       １３例标本不同采血管分离的血清或血浆室温下放置，１２ ｈ时ＥＤＴＡ-Ｋ２ 管平均降解了（２.６１±０.５６）％，比较其他采血管，其降解速率最慢。分离胶管平均每小时降解０.４６％，降解最快。在２４ｈ时，普通干燥管、分离胶管、肝素锂管、ＥＤＴＡ-Ｋ２管分别平均降解了（９.６６±１.６０）％、（１１.０１±１.６２）％、（８.００±０.９１）％、（３.８６±０.７６）％。放置７２ｈ时，分离胶管平均降解率达到（４１.２５±１.６８）％，仍为降解最快，而ＥＤＴＡ-Ｋ２管则仅平均降解（１５.７７±１.６５）％。见图１。

三、ＥＤＴＡ-Ｋ２抗凝血浆不同保存温度下不同保存时间检测结果
       ９例ＥＤＴＡ-Ｋ２抗凝标本即使存放于４℃，在７ｄ时与分离血浆即刻测定差异无统计学意义（Ｐ＞０.０５）；存放于－７０℃，７ｄ叠加反复冻融２次对测定结果无明显影响。见表１。

讨　　论
       健康成人血中的ＰＣＴ浓度很低，但在严重的全身感染时可以在２～４ｈ升高，并且很快就可以达到峰值。Ｍüｌｌｅｒ等通过对７９例怀疑感染的住院儿童进行研究，发现在严重感染（细菌、寄生虫或真菌感染）并有全身表现时，血ＰＣＴ含量明显升高，而病毒感染和局部细菌感染没有全身表现的患者血ＰＣＴ含量水平仅轻度升高。另外，监测血ＰＣＴ水平还有助于临床正确、合理使用抗菌药物。由于其在鉴别系统感染和非感染性炎症，及其严重程度、抗菌药物治疗、预后等方面发挥的重要作用，使其成为临床常规检测项目。临床常用血清作为检测标本，而在急诊检验工作中，多数用血浆标本做检验，用血浆作为标本的优点在于可以立即离心，缩短血液分离时间。不同的抗凝剂、不同的存放条件和不同的存放时间对检测结果是否有影响以及影响大小还不清楚。１９９７年Ｍｅｉｓｎｅｒ等曾对ＰＣＴ检测的影响因素做过研究，但其对有些影响因素（抗凝剂种类、标本的保存温度和保存时限）的研究还是比较局限，国内可以作为一定的参考但未必适用，国内是怎样的情况鲜有报道，为此我们对该方面做了进一步的探讨。
       在对普通干燥管、分离胶管、肝素锂管和ＥＤＴＡ-Ｋ２管的研究中，肝素锂管比ＥＤＴＡ-Ｋ２管偏低２.７６％。曾有报道，肝素对标记免疫分析影响程度的高低因方法与检测项目不同而不同。本试验使用电化学发光法进行检测，可能是由于肝素具有强酸性并带有负电荷，会影响化学反应的催化环境、缓冲体系甚至是化学反应本身，使其检测结果偏低。普通干燥管和分离胶管测定结果比ＥＤＴＡ-Ｋ２ 抗凝管结果分别偏高２.８４％、１１.４７％，至于造成这种差异的具体原因不明，还有待进一步探讨。用普通干燥管、分离胶管、肝素锂管、ＥＤＴＡ-Ｋ２管处理的血液标本，分离后室温存放，在１２、２４和７２ｈ测定均是ＥＤＴＡ-Ｋ２抗凝血标本降解速率最慢，前１２ｈ平均每小时降解速率不足０.２２％，即使存放７２ｈ也才降解（１５.７７±１.６５）％，平均每小时降解速率与前１２ｈ每小时降解速率基本一致。ＥＤＴＡ-Ｋ２抗凝血标本存放于４、－３０和－７０℃条件下，在７ｄ内基本无降解，甚至在－７０℃条件下保存即使反复冻融２次对检测结果的影响也很有限。
       为保证检测结果的准确、及时、有效，可以从提高检验人员的业务水平、改进工作流程、缩短检测时间等方面来减少标本放置时间过长带来的影响。血浆中的ＰＣＴ非常稳定，实验室可用常规的方法进行收集，无需特殊的储存条件。作为电化学发光法检测，本研究证实采用ＥＤＴＡ-Ｋ２作为抗凝剂采集标本不但缩短了标本检测，而且检测结果良好，并且长时间保存只具有很小的降解速率。但为了保证结果的准确，各个实验室应使用其各自方法推荐的抗凝剂在推荐的时间内进行检测。
                                                                                                                                          编辑：范伟伟