生化试剂常见的几种问题

新佐罗

       试剂空白吸光度是反映试剂质量的指标之一。每种试剂都有一定的空白吸光度范围试剂空白吸光度的改变往往提示该试剂的变质如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因含酚类物质被氧化为醌而变为红色。碱性磷酸酶、r-谷氨酰转肽酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或酚基苯胺而变黄。有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应在放置过程中其试剂空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD而下降。原则上吸光度上升的反应其试剂空白吸光度越低越好不能超过一个高限相反吸光度下降的反应其试剂空白吸光度不能低于一个低限。因此试剂空白吸光度限值常作为程序参数输入仪器如经核查超限仪器会自动报警提示更换试剂。需要指出的是还原型辅酶I或II等投料量不足或劣质的原料往往需要加大用量才使表观吸光度上升凑合过试剂空白核对的关其后果为如下情况。
       1 线性范围变窄现象高值测不高。原因生产试剂时有效成分投料量不足试剂成份稳定性较差。
       2 灵敏度变低现象酶促反应速度曲线斜率下降测定结果有严重系统误差。原因试剂底物浓度不足。
       3 低值偏高现象试剂空白的变化曲线吸光度VS时间明显波动。原因试剂自身不稳定自行分解工具酶纯度不够杂酶含量超限导致干扰作用。
       测定范围每种待测物都有一个可测定的浓度或活性范围样品结果若超过此范围分析仪将显示结果超过范围的提示。表示试剂已经变质应更换合格试剂。样品信息样品的溶血、脂血、黄疸等会对测定结果产生非化学反应的干扰。因此应根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性采用双波长或多波长的检测模式并在结果计算中扣除因溶血、脂血、黄疸引起的影响减少干扰程度。底物耗尽使用连续监测法、两点法测定酶活性时若酶活性非常高底物接近被耗尽吸光度上升或下降会超过某一吸光度变化范围监测期的吸光度将偏离线性使测定结果不可靠。校准与结果溯源性酶的校正要满足在同一方法学、同一测定条件、与理论计算的FACTOR值差异不大没有发现有明显影响因素方可进行校正。检验结果溯源性得建立一个可靠的参考系统作为准确性基础然后将准确性转移到常规方法测定中去使常规方法测定结果可溯源到参考系统所提供的准确性基础上来。在实现溯源性目标过程中永远以患者新鲜标本为实验对象以方法学对比试验方法为验证手段。
       方法学对比试验常采用回归方程进行统计分析假如斜率接近1截距较小这意味着实验室常规方法对标本测定结果和溯源目标参考系统对标本检测结果非常接近。临床化学中参考标准二级标准要有通用性但生产厂家提供的校准液并非通用的只适用于某一特定的分析系统。校准液标示值往往是按其基质偏差修正的所以标示值并非实际值。校准液、质控血清通常是经过处理的混合人或动物血清这种制备物在特定分析系统中往往与人新鲜血清反应性不同而产生基质偏差。如总胆固醇测定基质效应研究指出校准液酶法测定回收结果偏低可达57。酶的预活化测定血清中的某些酶如CK离体采血后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巯基-SH被氧化造成的。只有通过适当的还原作用才能重新激活。如CK-NAC试剂盒即含有CK活化剂名为N-乙酰半胱氨酸。实验研究证明NAC对血清中已失活的CK活化过程约需180 S。这就是CK测定为什么要延迟时间较长的理论依据。在ASTALT采用IFCC推荐方法测定时需要磷酸吡哆醛预活化。需要强调含有活化剂的生化试剂其测定酶活性的结果要高些。试剂抗干扰作用的合理性有些液体双试剂其实质并不真正具备抗干扰的能力而只是解决了试剂的液体化和稳定性问题。如ALT试剂盒中NADH在pH7.5~7.8水溶液中极不稳定在pH 8.7时才能稳定保存。因此为了保证试剂稳定性液体双试剂的R1需要维持pH 8.7但此时LDH活性大大下降就失去消除内源性丙酮酸的功能只有加入试剂R2后反应混合液的pH下降至LDH最适pH在经过延迟时间60 S后才能消除内源性丙酮酸的干扰。再如Tfinder反应中抗Vc干扰问题由于维生素c易氧化样品中Vc会竞争反应生成的过氧化氢而产生负干扰。因此在试剂R1中加入抗坏血酸氧化酶这种方法是有效的但不一定有很大的意义。因为Vc干扰必须同时具备二个条件aVc摄入量较多b采血后立即测定。实验表明离体血清中Vc在90 min后会全部被氧化。又如使用胺类新色原。分子共轭结构特性使得灵敏度提高相应可以减少样本用量最终能有效地降低干扰物的量.b使生成胺类色素原最大吸收峰由500520 nm移至550 nm以上以避开黄疸、溶血干扰。如亚铁氰化钾-H 0能有效避免黄疸干扰的理论依据是亚铁氰化钾与H0亲和力远远大于胆红素。甘油三酯测定有人主张选用双试剂方法消除内源性甘油这个方法是可行的但忽视了一个化学平衡理论。因为所有的酯在水溶液中都不是简单地以酯的形式存在而是以水解与酯化相平衡的形式存在。
       在一个平衡体系中如果去除游离甘油这个平衡就向生成甘油方向移动甘油三酯就会重新水解生成新的甘油达到新的平衡因此样品与R1试剂孵育时间越长测得甘油三酯值就越低。甘油三酯测定不仅要去除游离甘油而且还要克服样本含量真实性发生的变化试剂中必须加入甘油激酶并且延迟时间要标准化。所以一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时会带来样品含量真实性的变化。
                                                                                                        编辑：范伟伟