化学发光酶免疫试剂与ELISA试剂检测HIV抗体的对比分析

枫叶

                        贵州省CDC艾滋病性病皮肤病防治研究所    孙显光  里天初* 李志坚* 孙红平* 张信辉 应希堂*
                                                                                                        *北京科美东雅生物技术有限公司
       经多年的检测实践和试剂评估结果证明，在种类繁多的HIV筛查试剂中，仍然缺乏其特异性和敏感性能与酶免试剂媲美的不同原理的艾滋病检测试剂。这对提高HIV检测质量无疑是一大缺陷。因此，寻求一种设计原理不同，敏感性和特异性均符合HIV筛查和复检试剂要求的艾滋病检测试剂，显得非常必要。本文对化学发光酶免疫试剂与ELISA试剂检测HIV抗体方法进行对比分析。
1 材料与方法
       1.1 样本数量与来源 1000例已知HIV阳性样本为贵州省2007年艾滋病确认中心实验室经WB确认后的样本。12例现场样本来自中八农场，确认阳性10例，阴性2002例。
       1.2 仪器 微板光子计数分析仪(Chemiluinencent Analyser)由北京科美东雅生物技术有限公司生产，型号：KPS-KM；半自动酶标读数仪奥地利生产，型号：reader2010；全自动洗板机由奥地利生产，型号：anthos fluido24600型；全自动蛋白印迹仪由新加坡Genelabs公司生产，型号：Autoblot system20 AB3000。
       1.3 试剂  人类免疫缺陷病毒HIV(1+2)抗体诊断试剂盒，化学发光酶免试剂(简称CLIA)，由北京科美东雅生物技术有限公司生产，批号：发光试剂批号：20070627有效期：2007.12.26。
       1.3.1 酶免试剂1  人类免疫缺陷病毒(HIV)1+2型抗体酶联免疫诊断试剂盒(TA抗原夹心法)(简称ELISA )，由北京华大吉比爱生物技术有限公司生产，批号：吉比尔试剂批号：20070415有效期：2008.04.15。
       1.3.2 酶免试剂2  人类免疫缺陷病毒HIV 1+2型抗体酶联免疫诊断试剂盒(双抗原夹心法)(简称ELISA )，由上海科华生物工程实业有限公司生产，批号：科华试剂批号：20070615，有效期：2008.06.02。
       1.3.3 确认试剂(简称WB)  新加坡Genelabs公司生产(人类免疫缺陷病毒(HIV1+2型)抗体免疫印迹试剂盒HIV BLOT2.2WESTERN BLOT ASSAY)，批号：AE7027 有效期：2009.06.01
       1.4 方法
       1.4.1 化学发光酶免试剂盒，采用双抗原夹心(两步法)分析模式，预先用基因工程HIV(1+2)特异性蛋白抗原包被固相发光微孔板，加入血清或血浆标本后，待测抗体与包被抗原形成复合物，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的相同抗原，三者结合形成双抗原夹心结构，洗涤除去未结合的酶标抗原，加人HRP化学发光底物液，测定其发光强度(RLU)，根据临界值判断样本中是否含有HIV特异性抗体。
       1.4.1.1 自4℃冰箱中取出试剂盒，室温(18～25℃)平衡20 min。取一瓶20X洗液，加蒸馏水至600 ml，混匀后备用。
       1.4.1.2 将发光板从密封袋中取出，设空白对照1孔，不加样本稀释液和样本，设阴性对照3孔，阳性对照2孔，取阴性对照和阳性对照分别加入100 ul 于相对应对照孔中。其余每孔先加样本稀释液50 ul，再加入样本50 ul。微量震荡器充分振荡混匀，用不干胶片封盖反应板。
       1.4.1.3 发光板置37℃。温育30 min，小心甩去反应液，用稀释后的洗涤液洗板5次，每孔加满洗涤液，每次浸泡10 s，最后在干净的吸水纸上拍干。
       1.4.1.4 空白孔除外，每孔加入酶结合物100 ul，轻轻振荡 昆匀后，用不干胶片封盖反应板。
       1.4.1.5 发光板置37℃温育30 min，洗板5次，操作同上，拍干。
       1.4.1.6 使用前5 min将发光底物A液与B液1：1混合后，每孔加人底物工作液100 ul。
       1.4.1.7 置室温避光反应5 min后，用发光仪测定各孔R12值。
       1.4.1.8 临界值(CUTOFF)；2.1×阴性对照孔平均RLU值，待测样品RLU值≥ 临界值为HIV抗体阳性，待测样品RI U值<临界值为HIV抗体阴性。
       1.4.2 酶免试剂1、酶免试剂2操作方法按试剂盒说明书进行。
2 结果
       2.1 CLIA法与EL1SA法的实验结果  表中1010例WB确认阳性样本三种筛查试剂检测结果一致，2002例经WB确认阴性样本，三种试剂检测结果不同。经统计处理，CLTA与ELTSA1比较，CLIA与ELISA2比较，差异无显著意义(P≥0．5)。
       2.2 CLIA试剂与ELISA试剂特导性敏感性比较结果  见表1，我们的结果表明CLIA试剂有较高的敏感性。从表1可以看出，CLIA试剂和ELISA试剂敏感性均达到100%，完全满足HIV筛查和复检工作需要。在特异性方面，CLIA试剂特异性为99.95% 、ELISA1试剂为99.70%，ELISA2试剂为99.55%。符合HIV筛查和复检试剂要求。

3 讨论
       1977年，Arakawa等[1]将酶化学发光反应与免疫反应结合起来，发展了化学发光酶免疫分析方法(Chemi luminescence lmmunoassay，简称CLIA)。化学发光免疫分析方法的主要原理是将酶免疫发光物质标记在抗原或抗体上，免疫反应结束后，加入氧化剂或酶底物而发光，根据标准曲线通过测量发光强度来测定待测物的含量。Matsuda j [2]的实验结果认为，CLIA除有灵敏度高、特异性强、无有害污染、可实现自动化检测外，还具有线性范围广、标记物有效期长等诸多优点。
       通过两种ELISA试剂和CALIA试剂对经WB确认的1010例阳性样本和2002例阴性样本检测结果的比较分析发现，CALIA试剂作为不同设计原理的HIV检测试剂具有超高的敏感性和特异性，但统计分析无显著性差异，它既适用于手工操作又满足自动化仪器需要，无疑对我们提高HIV检测工作质量，探寻更好的筛查和复检试剂提供又一选择途径。

参考文献
[1] Arakawa H．，Maeda M ，Tsuji A Enzyme immunoassay of cortisol by cheniiuminescence reaction of luminol-peroxidase．Bunseki Kagaku．1977．26：322-326．
[2] Matsuda J，Tsukamoto M，Gohchi K，Kawasugi K，Gotoh M ，Kawamoto M ，Takizawa N，Kanno T；Fully automated chemiluminescence assay for the detection of antibody to human immunodeficiency virus type- 1
(HIV-1)/type-2(HIV-2)．11 th Intemational AIDS Conference． 1996．11：85．

                                                                                                        编辑：范伟伟