血液分析仪试剂作用原理及对检测结果的影响

孔雀明王

一、三分类血液分析仪试剂作用原理及对检测结果的影响
1、稀释液
1.1 稀释液作用原理
       a) 稀释血液细胞，防止血液细胞聚集和粘连；
       b) 保持稳定的pH、ρ、OS等理化指标：根据仪器设计理念不同，稀释液的理化指标有很大的差异，不同的仪器在用电阻法原理(图1)测量样本时，设定的脉冲信号阈值不尽相同（稀释液区分为高渗、等渗、低渗），因此同一份样本在不同仪器上直方图fl不同。以RBC直方图为例，灵敏度高的仪器配以理化指标稳定且范围精确的稀释液，可以将横坐标控制在60-150fl，反之，横坐标将会延伸到30-200fl 甚至更宽，直方图会发生左移或者右移。

1.2 稀释液对检测结果的影响
       稀释液是血液分析仪所有的测量环节都需要用到的试剂，稀释液的理化指标不合格,对仪器所有的检测结果都会造成影响。常见影响有PLT本底高，WBC分类不好，HCT漂移（HCT是检验试剂质量的重要指标之一），由于MCV、MCH、MCHC是计算参数，因此对MCV、MCH、MCHC的检测结果也会造成严重影响。

2、溶血素
2.1 溶血素作用原理
       a) 溶解红细胞，以利于白细胞计数：在以电阻法计数的三分类血液分析仪中，红细胞体积和白细胞体积有重合的区域，而且红细胞的个数是白细胞个数的近一千倍，因此在对白细胞进行电阻法计数时，必须加入溶血素，破坏掉红细胞，才能准确地对白细胞进行计数。
       b) 作用于白细胞膜，可使白细胞膜穿孔，胞浆流失（检测内核），胞浆流失后的白细胞中，因为只剩下细胞核，淋巴细胞最小，单核细胞稍大，中性粒细胞反而以大细胞形式存在。这样在电阻法对白细胞进行三分类的白细胞直方图上淋巴细胞在图形最左边区域，单核细胞在中间区域，粒细胞在直方图最右边区域。（如图2）

       c) 检测血液中血红蛋白浓度：
       目前国际血液标准委员会(ICSH)推荐的测试血液中血红蛋白的参考方法是氰化高铁(HiCN)法，所以大多数血液分析仪均采用氰化高铁法检测血红蛋白。当稀释的血液加入溶血素后，红细胞溶解，释放血红蛋白，后者与溶血素当中的氰化钾反应，形成氰化高铁血红蛋白溶液，进入血红蛋白测试系统，在特定波长（一般在530-550nm）下比色，吸光度的变化与样本中血红蛋白含量成正比。
       近年来，为了减少溶血素的毒性，避免含氰血红蛋白衍生物检测后的废物处理，有些血液分析仪使用非氰化溶血素（如SLS）。实验证明，形成的衍生物与HiCN吸收光谱相似，实验结果的精确性、CV值、线性达到含有氰化物溶血素同样水平，既保证了实验质量，又避免了污染。
2.2 溶血素对检测结果的影响
       溶血素试剂质量主要通过吸收峰波长、吸光度、PH值、空白值这几个指标来反映。吸收峰波长、吸光度不符合要求，会导致比色法测量HGB出现偏差。如果溶血素溶血不完全，则会造成红细胞没有被完全破坏，部分红细胞被当作白细胞计数，造成白细胞计数结果偏高。同时红细胞释放的血红蛋白反应不完全，导致仪器比色检测血红蛋白浓度时，造成结果失真。反之，溶血速度过快，在仪器规定测量血红蛋白时间之前，吸收峰波长和吸光度已经开始漂移，同样会造成血红蛋白及白细胞计数结果失真。

3、清洗剂
3.1 清洗剂的作用原理
       清洗剂主要是清除管道、计数池、检测小孔周围的蛋白沉积、污染。根据仪器的设计理念不同，可以在每次测试后使用或者关机时使用。目前市场上流行的清洗剂质量良莠不齐，价格差距也很大。一般来讲，血液分析仪清洗剂应含有活性酶，活性酶对去除管道以及计数池的蛋白沉积效果显著，但是由于含活性酶的清洗剂成本比不含酶的高很多，且保质期短，因此市场上含酶清洗剂的价格要比不含酶清洗剂的价格贵很多。
3.2 清洗剂对检测结果的影响
       清洗剂质量好坏的指标主要通过空白值和洗净率来反映。清洗剂空白值影响仪器的本底空白检测，洗净率则是反映清洗剂对仪器管路、计数池的清洁能力。清洗剂效果的好坏需要一段时间才能显示出来。长期使用质量差的清洗剂，会导致水路系统管道变色、变性、发硬、堵塞，会造成液体流通速度以及压力的改变，检测结果漂移，在每日做室内质控时会发现质控结果呈单方向漂移，系统误差显著。同时仪器的堵孔率也会增加，白细胞经常不分类。清洗剂质量对仪器能否保持正常运转起到重要作用。

二、五分类血液分析仪试剂作用原理及对检测结果的影响
       五分类血液分析仪试剂是由稀释液、多种类型溶血素、清洗剂、鞘液、染液等组成。其中稀释液、清洗剂的作用原理同三分类血液分析仪一样，这里就不再单独描述。下面主要就五分类血液分析仪溶血素、鞘液、染液的作用原理及对测量结果的影响做以下阐述。

1、血红蛋白溶血素
       顾名思义，血红蛋白溶血素在五分类血液分析仪中的作用只是测量血红蛋白，检测原理同三分类血液分析仪血红蛋白检测原理一样，唯一不同的是，三分类血液分析仪溶血素同时检测白细胞总数和分类。由于五分类血液分析仪所用血红蛋白溶血素是在单独的通道进行检测，因此当血红蛋白溶血素出现问题时，只会影响血红蛋白的结果，对白细胞总数和分类没有任何影响。

2、白细胞分类试剂（溶血素、染液）
2.1 白细胞分类试剂作用原理
       五分类血液分析仪由于各厂家白细胞分类原理不同，所用的试剂也不一样。主流五分类血液分析仪白细胞分类原理主要包括高频电导激光散射联合检测法（即VCS技术）、光散射和细胞染色联合检测法、电阻抗和射频电导联合检测法、多角度激光偏振光散射检测法等，但其方法不外乎光学法加荧光染色技术。所用试剂主要包括溶血素、染液。溶血素主要是嗜酸溶血素和嗜碱溶血素，染液则根据染色原理及染色目的不同，可分为化学染色、核酸染色、过氧化物酶染色等。现在主要从试剂方面对白细胞分类作用原理以及对检测结果的影响做以下阐述。
a) 光学法+核酸染色
①白细胞4分类通道
       在“DIFF”通道，嗜酸溶血素将红细胞与嗜碱性粒细胞破坏，保留中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞，然后核酸染色剂将上述保留细胞的DNA/RNA染色，由于各类细胞的核型不同、胞浆内DNA、RNA的含量不同、DNA/RNA染色强度不同，因此在分类散点图所占的位置即不同。利用激光和流式细胞原理（如图3），当血细胞通过检测通道时，在流式通道内，稀释后的血液从样本口低速进入快速运动的鞘液流中，因为稀释后的血样和鞘液的流速不同，所以不会混合，形成一个直径30微米的液流使血液样本呈一条细线穿过检测通道，在激光的照射下激发出荧光，根据荧光强度的不同以及不同角度的散射光绘制成二维散点图，对白细胞进行分类。散点图纵座标（Y轴）表示侧向荧光强度，反映核酸染料对DNA/RNA的染色强度，横座标（X轴）表示侧向散射光强度，反映细胞的内容物（核和颗粒）。

②白细胞计数和嗜碱性粒细胞通道
       在嗜碱溶血素的作用下,红细胞和血小板破碎，除嗜碱性粒细胞外的其他白细胞变成裸核。这样裸核数量加上嗜碱性粒细胞数量即为白细胞总数，再根据激光照射后散射光的不同，区分出嗜碱细胞。Y轴表示前向散射光，反映细胞体积，X轴表示侧向散射光，反映细胞内容物（核和颗粒）。结合上文4分类通道对白细胞进行4分类，即可完成对WBC总数计数及对白细胞的五分类。
b) 光学法+过氧化物酶染色
       用过氧化物酶染色剂对WBC进行初步区分，再结合嗜碱/核通道的差异裂解原理，最终将五种白细胞准确区分开来。过氧化酶染色技术主要是利用白细胞胞浆内各成分对过氧化物酶活性的差异来区分，其中嗜酸性粒细胞对过氧化物酶活性为“++++”，中性粒细胞对过氧化物酶活性为“+++”，单核细胞对过氧化物酶活性为“++”，而淋巴细胞和嗜碱性粒细胞与过氧化物酶不反应，这样通过染色的方法可将嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞区分开；同时结合嗜碱/核通道的差异裂解原理可将嗜碱细胞和白细胞总数检测出来，这样白细胞总数减去嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞即得出淋巴细胞数量，最终将五种白细胞准确区分开来。
c) 光学法+化学染色
       化学染色剂对细胞脂质和蛋白组分进行染色，在35度下进行孵育，对单核细胞的初级颗粒、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的特异颗粒进行不同程度的染色，同时对细胞的膜（细胞膜、核膜、颗粒膜）也进行不同程度的着色，由于淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞对染色剂的着色程度不同，在激光或氖灯的照射下，激发出的光强度也不同，每种细胞特定的细胞核形态和颗粒的结构造成光散射的强度不同，因此可以在散点图中同时得到嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞的结果。同时在BASO/WBC检测池中，全血样品与嗜碱溶血素混合，在35度恒温下，溶解红细胞，并使除嗜碱性粒细胞外的其他白细胞变成裸核。细胞通过鞘流微孔，每个细胞产生与细胞体积成正比例的电子脉冲，绘制出BASO/WBC直方图，依据阈值设定，区分出白细胞裸核和嗜碱性粒细胞，结合化学染色对白细胞进行四分类，即可完成对白细胞的五分类。
2.2 白细胞分类试剂对检测结果的影响
       从上文白细胞分类试剂作用原理我们可以看出，白细胞分类试剂种类繁多，而且起到的作用也各不相同。嗜碱溶血素只影响白细胞的总数和嗜碱细胞计数，对白细胞另外四分类不会产生影响；嗜酸溶血素和染液共同作用于白细胞其他四分类，它们试剂质量有问题，则会造成白细胞分类不好或者不分类。

三、网织红细胞、幼稚粒细胞、有核红细胞试剂

1、网织红细胞试剂（网织红细胞稀释液、染液）
1.1 网织红细胞试剂作用原理
       存在于网织红细胞稀释液中的表面活性剂使红细胞和白细胞肿胀并轻微损伤细胞膜以便染料进入细胞，网织红染液中的聚次甲基染料使RNA和DNA染色。由于红细胞和网织红细胞的RNA含量不同，所以可以将红细胞和网织红细胞区分出来；由于网织红细胞和白细胞DNA和RNA含量不同，可以将网织红细胞和白细胞区分出来。
1.2 网织红细胞试剂对检测结果的影响
       大部分仪器网织红细胞检测是在单独的通道使用单独的试剂，因此网织红细胞试剂不会影响到其他结果的检测。该试剂的质量只会对网织红细胞的相关参数产生影响。

2、幼稚粒细胞溶血素
2.1 幼稚粒细胞溶血素作用原理
       在“IMI”通道内，利用成熟粒细胞膜表面含较多量的脂质及较少量的蛋白质而幼稚粒细胞膜表面则相反的原理，检测时加入含聚乙二醇次乙基团和硫化氨基酸的幼稚粒细胞溶血素以破坏细胞膜，导致成熟粒细胞膜破坏而幼稚粒细胞膜部分受损，从而使聚乙二醇次乙基团和硫化氨基酸进入幼稚粒细胞与细胞膜和细胞内容物结合，不同的幼稚粒细胞对试剂的作用有所不同；再用直流电阻法测量细胞的大小，而射频则透入细胞内，测量细胞核的大小及核与胞浆的密度，这样即可检测出幼稚细胞数量并反映在以射频信号为纵轴，直流电信号为横轴的“IMI"散射图上，细胞数量并反映在以射频信号为纵轴，细胞体积和核的密度及大小的细胞占据的位置不同。RF测细胞核的大小及密度为Y轴，DC测细胞体积和数量为X轴（如图4）。

2.2 幼稚粒细胞溶血素对检测结果的影响
       幼稚粒细胞溶血素质量不稳定，则会导致对成熟粒细胞和幼稚粒细胞细胞膜的破坏程度出现偏差，导致检测幼稚粒细胞的结果出现偏差。幼稚粒细胞溶血素的质量只会影响幼稚粒细胞的检测。不会对其他结果造成影响。

3、有核红细胞试剂（有核红细胞溶血素、染液）
3.1 有核红细胞试剂作用原理
       有核红细胞溶血剂中表面活性剂可使成熟红细胞破碎，有核红细胞的核暴露，同时在白细胞膜上打孔。染液中的聚次甲基荧光染料进入白细胞和有核红细胞内对核酸（核膜）进行染色。应用半导体激光束照射标本，根据侧向荧光和前向散射光信号的强弱即可辨认有核红细胞并进行计数。
3.2 有核红细胞试剂对检测结果的影响
       有核红细胞染液的荧光性能（吸收光束的能力）、对细胞膜的渗透性、对靶细胞成份发出荧光的强度以及其化学稳定性都会影响到有核红细胞的检测结果。同网织红细胞、幼稚粒细胞一样，有核红细胞的试剂只会对有核红细胞的检测结果产生影响，不会影响到其他结果计数。

四、其他试剂

1、鞘液
1.1 鞘液作用原理
       大部分高端血液分析仪为了提高检测的精度，都应用了鞘流原理，主要应用的试剂就是鞘液。鞘流形式有单鞘流和多鞘流，目的都是使细胞呈一条直线经过检测部。在鞘流池中（一般分为前后鞘流池或者内外鞘流池）采用正压方式将鞘液注入，鞘液在鞘流池中形成固定方向的涡流，这个时候再把样本用正压的形式注入，那么所有的标本无一例外只能按流动方向流过鞘流池，这就形成鞘流方向，在这个方向上进行电阻计数或者吸光度计数或者光散射计数，就能充分保证正确计数每个细胞，并且保证足够的通过数量，还可以保证计数后的的样本不会回流回来，由于有鞘流保护，样本会在鞘流的正中心通过计数管道或孔，因此不会出现偏差的干扰信号，可以保证每个细胞的游离。
1.2 鞘液对检测结果的影响
       由于鞘液需要包裹着被检测样本经过检测部接受激光照射或者电阻抗法计数，因此鞘液的洁净度、吸光度、pH值、渗透压都要满足仪器的设计要求，否则都将会对仪器的检测结果产生影响。

2、可以对血细胞进行等体积球形化处理的稀释液
       有的血液分析仪还需要在稀释液中加入戊二醛和十二烷基硫酸钠等试剂，目的是计数前先对血细胞进行等体积球形化处理，这样计数时就可以避免因体积大小不同造成对血细胞计数造成的影响。（图5 图6）

       以上阐述了血液分析仪试剂的作用原理及对检测结果的影响，从中可以看出每一种试剂都有不同的作用，如何防止试剂对检测结果的影响，则需要我们在完善试剂质量控制体系，以及研发适用于配套试剂及仪器的标准物质方面多下功夫。

                                                                                                      编辑：范伟伟