流式细胞技术检测脑脊液T淋巴细胞亚群的临床应用前景

真诚永远

                                                                            北京大学第一医院神经内科  李珺 郝洪军 高枫 黄一宁
       摘要： 脑脊液T淋巴细胞亚群在多发性硬化(MS)、中枢神经系统感染性疾病、古兰-巴雷综合征(GBS)及中枢神经系统血管炎等常见的神经系统免疫相关性疾病中有各自的分布特点。相对于手工计数法和免疫组化检测方法，应用流式细胞技术检测脑脊液T淋巴细胞亚群，在神经系统免疫相关性疾病的诊断方面有巨大的应用前景，此文对此做一综述。
       关键词：流式细胞技术；T淋巴细胞亚群；脑脊液；神经系统免疫相关性疾痫

       许多神经系统疾病，如多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、吉兰-巴雷综合征(Guillain—Barre syndrome，GBS)、中枢神经系统血管炎、脑膜脑炎等的发病机制都与免疫反应相关。目前临床对这些疾病患者脑脊液的免疫细胞检测方法尚局限于传统的手工计数法。手工检测的缺陷是检测周期长，检测者主观误差较大，且不能在分子层面上进行区分。近10年来研究者逐渐发现淋巴细胞亚群对神经系统疾病诊断具有很大帮助，寻找一种快速精确检测淋巴细胞亚群的方法，将会使神经系统免疫相关性疾病的辅助诊断水平明显提高。流式细胞技术是利用流式细胞仪对生物颗粒进行多参数、快速定量分析的现代细胞分析技术，具有比手工检测精准、比免疫组化检测方便快捷的优点，该法具有巨大的临床应用前景。流式细胞技术目前已经在血液系统检测中广泛应用，利用该技术检测脑脊液免疫细胞亚群也将成为未来的发展趋势。此文主要综述流式细胞技术检测脑脊液T淋巴细胞(T细胞)亚群在神经系统免疫相关性疾病的现有研究成果，并探讨其临床应用前景。
1、流式细胞技术检测T细胞亚群的方法及其优点
       T细胞是一群由胸腺中输出的具有特殊标志的细胞，其执行细胞免疫的功能及免疫调节功能，根据其表面分化抗原(cluster of differentiation，CD)不同可以分成不同的亚群，如CD4是辅助性T淋巴细胞，它是迟发性超敏反应的启动者，是促使B淋巴细胞(B细胞)产生抗体的辅助细胞，也是抑制性T细胞的诱导细胞，而CD8是抑制性T细胞，它是细胞毒性T细胞介导反应的效应细胞，是抑制B细胞产生抗体的抑制性细胞。
       采用流式细胞技术可以进行淋巴细胞亚群分析，区分不同的淋巴细胞亚群并计算其相互问的比例，进而了解淋巴细胞的分化功能。更重要的是通过研究大多数疾病的特异性淋巴细胞亚群，对一些疾病，如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植监测等具有重要临床意义。国内有报道称，采用流式细胞技术进行脑脊液细胞分类计数，其结果与手工镜检法具有可比性，且某些参数优于手工镜检法，而且国外也有类似报道。
2、正常脑脊液的淋巴细胞表型分布
       de Graaf 等 对84例非神经系统疾病患者脑脊液白细胞亚群绝对计数和百分比的研究发现，与血液相比，脑脊液淋巴细胞亚群的特点为：T细胞数量占绝对优势，粒细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)则相对较少；在T 细胞中，以CD4+T细胞为主，其中约90%为记忆性CD4+ T细胞(表1)。

3、 流式细胞技术在一些疾病中的应用
       目前，该技术检测脑脊液淋巴细胞亚群在MS中的应用已有较多研究，而应用于其他神经系统免疫相关性疾病的研究相对较少，其可能原因为：(1)人们多认为使用流式细胞技术检测脑脊液较手工计数法更精确，能发现手工计数法无法发现的问题，对于脑脊液细胞数明显增多的中枢神经系统感染而言，手工检测已可以对细胞进行大体分类和计数，流式细胞技术在这类疾病上似乎没有应用优势。(2)某些神经系统免疫相关性疾病如中枢神经系统血管炎发病率远低于MS，标本数量不足限制了对这类疾病的研究。然而，不同类型病原体感染的脑脊液淋巴细胞亚群的分布不尽相同，当常规脑脊液检查无法区分中枢神经系统感染类型时，流式细胞技术则提供了一种新思路。
       3.1 MS MS确切的发病机制尚不清楚，目前被普遍接受的观点为，MS是在易感基因基础上，受环境因素触发后由T细胞介导的中枢神经系统自身免疫性疾病。
       3.1.1 MS的T淋巴细胞亚型变化：传统规念认为，MS 发病几乎完全受CD4+T 辅助细胞(T helper cell，Th)调控，其中Th1细胞起主要作用。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyclilis，EAE)形究中通过抑制CD4+ T细胞能防止疾病复发和进展。然而近来人们发现，对EAE有效的CD4+ T细胞靶向治疗药物并未改善MS患者的疾病进程，甚至还加速了疾病恶化。同时还发现CD8+ T细胞同样参与了发病过程，在MS病变部位CD8+ T细胞数量多于CD4+ T细胞，提示CD4+ 与CD8+ T细胞共同介导了MS的组织损伤。
       近年来，CD4+ CD25+ T细胞在MS发病中的作用越来越受到关注，它被称作调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)，可以限制免疫反应过度引起的组织损伤，是维持免疫系统平衡的主要因素，若Treg数量减少或功能下降将引起自身免疫性疾病。Viglietta等对复发缓解型MS患者和健康对照的外周血 Treg数量和功能进行研究，发现两组Treg数量没有明显差异，但MS患者Treg功能明显降低。叉头样转录因子(forkhead box P3，FOXP3)是Treg的特异性转录因子，该转录因子表达降低也可部分说明MS患者Treg的功能降低。
       3.1.2 MS患者脑脊液T淋巴细胞业群分析的临床应用前景：首先，流式细胞技术检测淋巴细胞亚群，有利于探索疾病的发病机制，研究疾病的靶向治疗方案。其次，对淋巴细胞亚群的检测有利于疾病鉴别。例如，一项对慢性疲劳综合征、MS、抑郁症患者及健康对照的血液学榆测发现，上述疾病中脑脊液T、B、NK细胞总数没有差异，而其细胞亚群分布却存在差异。在临床工作中，某些MS患者因临床表现、影像学改变以及脑脊液常规实验室检查结果不典型，致使其与如急性播散性脑脊髓炎、肿瘤等其他疾病不易 分。但这些疾病发生的免疫机制截然不同，通过淋巴细胞亚群分析，很可能找到其不同特点，为临床鉴别诊断提供更多参考信息。目前尚缺乏上述疾病淋巴细胞业群分析的相关报道，仍需进一步完善研究。再次，通过检测脑脊液淋巴细胞亚群还可以分析MS的疾病活动情况。Khoury等研究发现，活化T细胞亚群与MS疾病活动性相关，在疾病活动期，T细胞活化标志CD25、CD26上调，而T细胞总数和CD4+ T细胞数量则与疾病活动程度无关。
       3.2 中枢神经系统感染性疾病 中枢神经系统细胞免疫反应常仅发生于脑脊液中，故对脑脊液免疫细胞成分进行分析是研究中枢神经系统细胞免疫功能和特征的重要途径。
       3.2.1 病毒性脑(膜)炎的淋巴细胞亚群分析：一般认为病毒感染的免疫病理机制足以T细胞介导为主的细胞免疫反应。赵德明等应用免疫细胞化学技术[指的是链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶(SP法)染色]对病毒性脑(膜)炎急性期患者的脑脊液进行研究，以CD3和CD20作为T细胞和B细胞的标记物，发现病毒性脑(膜)炎组CD3和CD20表达阳性率与健康对照组相比均有统计学差异，并且病毒性脑(膜)炎组CD3表达阳性率较CD20表达阳性率明显增高，表明病毒性脑(膜)炎急性期的免疫反应是以T细胞参与为特征的细胞免疫为主。
       3.2.2 细菌性脑膜炎的淋巴细胞亚群分析：细菌性脑膜炎同样存在T 细胞反应异常。Ichiyama等使用流式细胞技术对10例细菌件脑膜炎急性期儿童脑脊液单个核细胞亚群进行分析，结果发现细菌性脑膜炎患者CD3+、CD4+ 和CD8+ T细胞在脑脊液中比例显著高于血中比例，CD3+ 、CD4+ 和CD8+ T细胞在细菌性脑膜炎患者血中比例显著低于健康对照组。该试验不足之处是缺乏健康儿童脑脊液作为对照。
       3.2.3 脑脊液T 细胞亚群分析用于临床不同病原体感染的鉴别诊断：多数时候不同病原菌引起的中枢神经系统感染可通过脑脊液常规检查实现诊断和鉴别诊断。但在该类疾病发病初期，腩脊液变化尚不明显，此时诊断与鉴别诊断存在一定困难，而且临床工作中通过脑脊液常规检查不易区分新型隐球菌脑膜炎和结核性脑膜炎。不同病原体感染的发病机制不尽相同，所涉及的淋巴细胞亚群改变也应有所鉴别，故脑脊液淋巴细胞亚群分析有可能为以上疾病的诊断和鉴别诊断工作提供了分子生物学平台，具有较大的研究价值。
       3.3 GBS  GBS是一种免疫介导的疾病。主要累及周围神经，导致其炎性脱髓鞘的病理改变，脑脊液常规检查的典型特征是蛋白细胞分离现象，即脑脊液中蛋白含量，而细胞数目则基本正常。日前对GBS的淋巴细胞亚群分析主要集中于血液，对脑脊液的淋巴细胞亚群研究则很少。Fumihito Yoshii等对18例GBS患者发病初期血液进行检测则发现，CD3+ 、CD4+ 、CD8+、CD45RA+ T细胞较健康对照组增加，经过血浆置换治疗后，这种淋巴细胞亚群的改变趋于正常。可见，淋巴细胞亚群分析有助于诊断GBS和判断药物疗效。
       3.4 中枢神经系统血管炎 对原发性中枢神经系统血管炎组织进行免疫组化检查，发现病变血管周围的淋巴细胞大多数为T细胞。原发性中枢神经系统血管炎的肉芽肿没有自身抗体或免疫复合物在血管壁上的沉积，提示其为一种T 细胞介导的非特异性炎性反应 。日前有关中枢神经系统血管炎患者的脑脊液淋巴细胞亚群的报道尚不多见，有待于进一步研究。
4 展望
       MS因其发病率相对较高，脑脊液淋巴细胞亚群分布有显著特点，以及该研究对治疗上的应用价值，使脑脊液淋巴细胞业群分析在MS一直有较多研究，但淋巴细胞亚群分析对于其他常见的神经系统免疫相关性疾病的发生机制研究、疾病的诊断和预后判断以及靶向治疗研究上也同样具有重要的应用价值，有待于进一步更大样本的研究，相信应用流式细胞技术检测脑脊液淋巴细胞亚群在神经系统免疫相关性疾病的临床工作中必将有着巨大的应用前景。
                                                                                                    编辑：范伟伟