地高辛血药浓度测定方法的应用与分析

亮仔

　地高辛(Digoxin)临床用于慢性充血性心力衰竭及心房纤颤、心房扑动等的治疗,因其作用机制复杂,治疗安全范围小,药动学、药效学个体差异大,且血药浓度与药物的疗效和毒性密切相关,故在临床治疗过程中,及时监测地高辛的血药浓度具有特别重要的意义。为此本文综述了近年来国内外地高辛血药浓度测定的相关文献,为满足不同的临床检测需求提供参考依据。
1  免疫测定法( IA)
      免疫测定法是目前地高辛血药浓度检测主要方法,该法是基于抗原抗体反应的特异性和敏感性的免疫学原理,运用不同的标记物和检测方式检测标本中微量物质的分析方法。
      1.1　放射免疫测定法(RIA) 　RIA是将高灵敏度的放射性核素示踪技术与高特异的免疫化学技术相结合的一种超微量免疫测定方法,即用放射性核素标记抗原后,使之与受检标本中的抗原竞争抗体,检测标记抗原抗体复合物的放射性强度,据此确定地高辛浓度。文献用R IA测定体内地高辛,其检测限为0.01μg/L,平均回收率为101.3%,日内RSD = 3.0%,日间RSD = 6.5%。地高辛放射免疫试剂盒的应用使得该方法具有更高的敏感性、精密度、准确度和特异性。R IA法有价格便宜、方法简单、结果可靠、灵敏度较高等优点,但也存在着一些缺点,如放射性污染、标记物半衰期短、批间RSD偏大、检测时间过长,容易受代谢产物的干扰,与内源性洋地黄样物质( EDLS)有交叉反应等 。虽然如此, R IA法仍以其经济实用的绝对优势在治疗药物监测中占有一席之地。
      1.2　酶免疫测定法( EIA) 　EIA是在放射免疫分析理论的基础上,用酶标记抗原或抗体作为示踪物的非放射性免疫分析技术,其灵敏度与R IA法接近,具有特异性强、灵敏度高、操作简便快捷、酶标记物稳定、有效期长等优点,克服了R IA放射性危害和标记物半衰期短的缺点。
      1.2.1　酶联免疫吸附分析法( ELISA) 　ELISA 是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测技术,属于非均相免疫分析,当反应物抗体过量时,酶标记抗体与被测物含量成正比,据此检测地高辛浓度。文献应用特异性地高辛多克隆抗体,建立了一种新的地高辛酶联免疫吸附分析方法,灵敏度高达0.04 ng/ml,所需样品量仅为5.0μl,且几乎不需预处理,可以免受地高辛样活性物质的干扰。ELISA法虽然提高了检测的准确性及可靠性,样品预处理步骤得到简化,但所需孵育时间较长,操作中人为干扰因素较多,酶的稳定性也易受温度和pH的影响。
      1.2.2　克隆酶免疫测定法(CEDIA) 　CEDIA是一种新型的均质酶免疫测定方法,其检测的原理是利用DNA技术把β2半乳糖苷酶完全裂解成为酶受体和酶供体2个无活性片段,当两片段相遇重组时,就可形成具有催化活性的酶,此酶水解底物氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷产生紫红色氯酚红,血清地高辛浓度与该酶生成量成正比。文献证明了在测定地高辛血药浓度时, CEDIA与R IA法相关良好( r = 0.9265) ,也就是说CEDIA法是比较可靠的。文献用该法对质控血清进行批内或批间重复性测定数据统计分析,表明CED IA法的批内和批间变异系数均不超过5% ,完全符合免疫分析精密度的要求。CED IA法精密度好、快速、准确,易于自动化、无放射性污染,特别适用于地高辛中毒患者的急症检测。在监测地高辛血药浓度时,此种方法的EDLS的交叉反应性低于荧光
免疫测定法。
      1.3　荧光免疫测定法( F IA) 　荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种,这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术,至今免疫荧光技术已广泛应用于微量、超微量物质分析测定。
      1.3.1　荧光偏振免疫测定法( FP IA) 　FP IA是一种基于蛋白竞争结合原理的免疫技术,是荧光偏振法和免疫竞争法的结
合,利用被测物质中被测对象所具有的偏振光特性进行测量。荧光偏振免疫分析仪( TDX)及配套试剂盒的使用,使得这项检测技术更加快速、简便、灵敏(最小检出量为0.01 ng/ml) ,分析误差范围在2.57%～4.00%。人体血清中的EDLS会与免疫分析法中的地高辛抗体产生交叉反应,以TDX仪最低检测限0.26 ng/ml为检出标准,心力衰竭患者血清EDLS检出阳性率为46.7% ,其浓度范围0.26～1.52 ng/ml,平均浓度(0.55 ±0.44) ng/ml,提示在监测地高辛血药浓度时, FP IA测定结果易受EDLS的干扰。FP IA法类似于R IA,但测定周期短,不需分离游离及结合的荧光标记物,无放射性污染。在试剂稳定性、精密度、灵敏度方面优于EIA,对样品预处理简单,整个测定过程耗时较少,能快速、有效地提供数据(0.5～1h即可出检测报告) ;但易受本底荧光的干扰,所用仪器复杂,与其他强心甙类药物以及EDLS存在交叉反应,容易造成地高辛浓度偏高的假象。
      1.3.2　时间分辨荧光免疫测定法( TRF IA) 　TRF IA为一种新型非放射性免疫标记技术,利用了具有独特荧光特性的镧
系元素及其螯合物为示踪物,代替荧光物、酶、同位素、化学发光物质,待反应体系发生后,用时间分辨荧光免疫分析检测仪
测定反应产物中的荧光强度,根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值,判断反应体系中分析物的浓度从而达到定量分析。文献用TRF IA法测定地高辛血药浓度,最低检测限远小于0.2 ng/ml,比R IA法降低了4个数量级,其灵敏度大大地超过了R IA所能达到的极限,且交叉反应率低于FP IA法。与FP IA、R IA 相比, TRF IA 具有灵敏度高、操作简便、示踪稳定、标准范围宽、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染、多标记等优点。
      1.4　化学发光免疫测定法(CL IA) 　CL IA以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗
原,当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后,发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用,发生氧化还原反应,反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光,最后用发光光度计进行检测。文献用该法检测血清地高辛浓度,最低检测限仅为0.1 ng/ml,线性范围为0～4.0 ng/ml,日内RSD< 4% ,日间RSD < 6.5%。CL IA在可靠性和灵敏度方面完全符合临床检测要求。化学发光标记物有效期长、试剂稳定性好、反应快速,适宜大量临床样品检测,与其他强心甙类药物及内源性地高辛样免疫物质不存在交叉反应,尤其适合监测内源性地高辛样免疫物质较高或用含夹竹桃等强心甙类草药急救患者的情况。但仪器设备及配套试剂目前均依赖进口,导致检测费用昂贵,应用受限。
      1.5　干化学测定法(Dry chemical assay) 　干化学测定法是采用异种酶排斥免疫原理,用干化学分析技术结合全自动生化分析仪测定地高辛血药质量浓度的方法。地高辛干片是一种干燥的、多涂层在透明的聚合物支撑基片上涂有测试性物质的干片,其分布层中含有抗地高辛抗体和地高辛过氧化物酶结合物。有色物质的形成率和地高辛的浓度成反比。实验结果表明该方法测定地高辛质量浓度在0.5～4.0μg/L有很好的线性关系( r = 0.9989 ) ,测定平均回收率为99.0%。日内平均RSD = 4.5 % ,日间平均RSD = 4.8%。该方法大大简化了操作程序,缩短了检测时间,降低了检测费用,较FP IA 更适用于急诊检测。但有研究表明,此法对血地高辛浓度的平均测定值明显高于FP IA。
      1.6　乳胶免疫抑制法( Emul Immuunodep ression) 　乳胶免疫抑制法的原理为免疫竞争抑制,血清中的地高辛与含有地高辛抗体的缓冲液中的抗体发生中和反应后,缓冲液中剩余的抗体再与标记地高辛的乳胶反应,产生的浊度在700 nm波长
下比浊,其浊度与血清中地高辛的浓度成反比。其检测速度快,标本用量小,对人体无伤害,对环境无污染,但目前应用报道较少。
2　液相—质谱联用分析法(HPLC-MS-MS)
      HPLC-MS-MS是继R IA和FP IA检测之后分辨率更高的一种检测方法,样品先经HPLC分离,再经MS-MS检测确定地高辛含量。文献利用该分析法用于大鼠血地高辛浓度检测研究,其批内分析和批间分析精确度的相对标准差控制在8.6%以内,其定量值的下限是0.1 ng/ml,预计浓度和正常参考值之间的平均偏差在3.7%以内,与放射免疫测定法比较,特异性较强,但灵敏度稍差,从而可克服R IA 测定血地高辛浓度时因EDLS 产生的干扰。HPLC-MS-MS法具有快速、准确、抽血量小、可批量检测、样品清理简单,不易产生交叉反应等优点,但操作繁琐、费时,且该类仪器价格昂贵,因此其临床推广应用严重受限。
3　毛细管电泳分离法(CE)
      毛细管电泳又称高效毛细管电泳(HPCE) ,近年发展起来的一项新型分析技术,兼有电泳和色谱技术的双重优点。以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相微分离技术。利用CE检测地高辛,是将酶促反应产物(NADH) 、剩余物(NAD + )和内标物在电运动的作用下,注入聚丙烯酰胺电泳毛细管,然后在电场强度作用下根据它们各自分离系数的不同再将其分离,对发生溶血、高脂血症、黄疸的血清样本地高辛浓度分析有一定优势。毛细管电泳技术以高效、高速、高灵敏度、高自动化以及样品和试剂耗用量少等一系列优点,广泛应用于药物研究和分析之中,但应用地高辛检测的报道尚不多。
4　分析及束语
      以上介绍的各种地高辛检测方法均以各自独特的优势在临床应用,其中利用免疫学原理的测定方法是目前测定地高辛血药浓度的主要方法;另外,具有更高敏感性、特异性和快捷性的血清地高辛浓度监测新方法如逆转录PCR 技术、抗地高辛抗体片段技术等也日趋成熟。
                                                                                                                                  本文编辑：范伟伟