流式细胞仪的简要介绍和注意事项

亮仔

　　一、流式细胞仪的检测范围
  　　1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
  　　2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
  　　二、流式细胞仪的临床应用
  　　1．流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡；
  　　2．流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞（CD34+）计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测；
  　　3．流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。
  　　三、流式细胞仪的科研应用
  　　主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。
  　　四、流式细胞术常规检测时的样品制备
  　　(一) 直接免疫荧光标记法
  　　取一定量细胞(约1 × 106 细胞／ml )，直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，孵育20-60分钟后，用PBS（pH7.2 － 7.4）洗1-2 次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
  　　(二) 间接免疫荧光标记法
  　　取一定量的细胞悬液(约1X106 细胞／ml )，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
  　　另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
  　　五、质量控制和注意事项
  　　流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。
  　　（一）流式细胞术免疫学检测的影响因素和质量控制
  　　流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用，其免疫荧光染色的标本制备非常重要，常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接免疫荧光染色中)或细胞浓度低等影响检测结果。解决这些影响因素的方法如下：
  　　(1) 确保标本上机检测前的浓度为 1 X 106 ／ml，细胞浓度过低直接影响检测结果。
  　　(2) 使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0.5％牛血清白蛋白和1 ％胎牛血清。
  　　(3) 荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。
  　　(4) 设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。
  　　(5) 判定结果时，应注意减去本底荧光，为使免疫荧光的定量分析更精确，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的免疫荧光定量结果。
  　　(6) 注意染色后避光，保证细胞免疫荧光的稳定。
  　　（二）DNA 倍体分析的质量控制仍没有统一的标准， 各文献报道的实验结果差异较大，
  　　1 9 9 3 年1 0 月美国癌症研究组织制定了FCMDNA 测定的统一标准，我们根据这些标准并结合国内有经验的专家多年的实践，对FCM 的DNA 分析技术的质控和注意事项进行说明。
  　　(1) 手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。
  　　(2) 标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，D NA 降解，而造成测试结果的误差。
  　　(3) 固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度，70％的乙醇固定效果较好。
  　　(4) 单细胞悬液制备过程中，注意将待测细胞成分分离出来，减少其他成分的干扰，并注意不要损伤该群细胞。
  　　(5) 细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度，即1X106／ml，杂质、碎片、团块和重叠细胞应<2％，对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品，至少有20 ％的肿瘤细胞存在。
  　　(6) 石蜡包埋组织单细胞制备时要注意：
  　　取材时应选取无自溶、坏死的组织，对肿瘤组织标本，选取含肿瘤细胞丰富的区域；
  <P>　　石蜡组织片的厚度要适宜，最好为40-50 μm 。过薄或过