血液涂片的制作与染色

龙虎豹

　　做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节。
  　　一．玻片的清洁
  　　1．一般清洗法
  　　（1） 将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。
  　　（2） 用热水将肥皂和血膜等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。必要时再置95%乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用。 新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 %盐酸浸泡24小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。
  　　2．油污载片清洗法
  　　（1） 清洗液
  　　甲液：10g/L的过锰酸钾水溶液，乙液：25g/L的草酸水溶液。
  　　（2） 清洗方法：将用过的玻片投入甲液数小时，取出后再投入乙液数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后再置95%乙醇中，以毛巾擦干净即成。久用后甲液可出现泥沙样沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花滤去再用，如乙液褪色应重新配置。
  　　二．血涂片制作
  　　取末梢血1滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载片保持30 ～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号。
  　　一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。
  　　涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50%的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。如果血膜分布不匀，主要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。
  　　三．染色
  　　1．瑞氏染色法 （Wright staining）
  　　本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞中 的特异性颗粒着色较好，但对核的着色较差。
  　　（1） 原理 瑞氏染粉是由伊红和美蓝混合后组成的一种中性盐染料。伊红是一种酸性染料，为伊红钠盐，其有色部分为阴离子；美蓝是一种碱性染料，为氯化美蓝，有色基团为阳离 子。如以M+代表美蓝，以E-代表伊红，其反应式为：
  　　M+Cl-  +Na+E→ ME↓+NaCl
  　　美蓝　 伊红  伊红化美蓝（瑞士染料）
  　　将适量的ME溶解在甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用可使ME溶解，解离为M+和E－，这两种有色离子可以选择性地吸附血细胞内的不同成分而着色。甲醇的另一个作用是有很强的脱水作用，可将细胞固定为一定形态，当细胞发生凝固时，蛋白质被沉淀为颗粒状或者网状结构，增加细胞结构的表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。
  　　细胞的着色过程是染料透入被染物并存留其内部的一种过程，此过程既有物理吸附作用，又有化学亲和作用。各种细胞及细胞的各种成分由于其化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样，因此，在血片上可以见到不同的着色。细胞中碱性物质与酸性染料伊红结合染成红色，因此该物质又称为嗜酸性物质。如，红细胞中的血红蛋白，嗜酸 性粒细胞胞浆中的颗粒为碱性物质，这些物质可与伊红结合染成红色。细胞中的酸性物质可与染液中的碱性染料美蓝结合染成蓝色，该物质又称嗜碱性物质，如：嗜碱性粒细胞中的颗粒为酸性物质可与碱性染料美蓝结合染成蓝色。细胞核主要由脱氧核糖核酸和 强碱性的组蛋白、精蛋白等形式的核蛋白所组成，这种强碱性的物质与瑞氏染液中的酸 性染料伊红结合成红色，但因为核蛋白中还有少量的弱酸性物质，它们又与染料中的碱 性染料美蓝作用染成蓝色。但因含量太少，蓝色反应极弱，故核染色呈现紫红色。幼稚 红细胞的胞浆和细胞核的核仁中含有酸性物质，它们与染液中的碱性染料美蓝有亲和 力，故染成蓝色。当细胞含酸、碱性物质各半时，它们既与酸性染料作用，又与碱性染 料作用，染成红蓝色或灰红色，即所谓多嗜性。当胞浆中的酸性物质消失时，只与染液 中的伊红起作用，则染成红色，即所谓正色性。
  　　（2） 试剂
  　　①.瑞氏染液
  　　瑞氏染料 （粉） 1．0g
  　　纯甲醇 （AR 级以上） 600．0 ml
  　　将全部染料放入乳钵内，先加少量甲醇慢慢地研磨 （至少半小时），以使染料充分 溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒人洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶 解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。 密闭保存。
  　　②.磷酸盐缓冲液 （pH6．4 ～6．8）
  　　磷酸二氢钾 （KH2PO4） 0．3g
  　　磷酸氢二钠 （Na2 HPO4） 0．2g
  　　蒸馏水 加至1000．0ml
  <P>　　配好后用磷酸盐溶液校正pH ，如无缓冲液可用新鲜蒸馏