尿白蛋白检测现存问题与解决方案

孔雀明王

作者：俸家富
单位：四川医科大学附属绵阳市中心医院检验科

1982年Viberti等发现1型糖尿病患者尿总蛋白在参考区间内，而尿白蛋白(urine albumin, UAlb)排泄增加，提出了"微量白蛋白尿(microalbuminuria)"概念[1]。尿微量白蛋白(urine microalbumin)是指尿中含量超出健康人参考区间，又不能用传统方法(如磺柳酸法或试带法等)检测出的白蛋白(albumin，Alb)，其本质是Alb，来源于血浆，与血浆白蛋白同质。2009年前，将UAlb排泄在30～300 mg/d，或其随机尿浓度为20～200 mg/L，或白蛋白排泄率(albumin excretion rate，AER)在30～300 mg/d之间的尿称为"微量白蛋白尿"[2]。

为解决UAlb现有检测方法学存在的问题，美国肾病教育计划(National Kidney Disease Education Program，NKDE)和国际临床化学联合会(International Federation of Clinical Chemistry，IFCC)尿白蛋白检测实验室工作组，共同起草了"尿白蛋白检测和报告现存问题"的专家共识[3]。建议使用术语"尿白蛋白"，摒弃"微量白蛋白(microalbumin)"，以避免"微量白蛋白"与"小白蛋白分子(small albumin molecule)"相混淆。改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease: Improving Global Outcomes, KDIGO)在2012年发布的慢性肾病治疗指南中也建议不再使用术语"微量白蛋白尿"[4]。如今，术语"微量白蛋白尿"与"尿微量白蛋白"还在某些领域使用，诣在警示糖尿病、心血管疾病患者易发慢性肾病高风险的可能[4]。

一、尿白蛋白检测的现存问题

尿白蛋白检测准确度问题存在两大方面争议。首先，越来越多的人认识到尿中存在修饰性Alb或Alb片段，(1)尿液中修饰Alb百分比较血液高[5]；(2)糖尿病患者尿中Alb异构体和酸性Alb较多[6]；(3)尿中存在多种类型的Alb片段[7,8]。但UAlb检测却使用血清Alb作校准。因此，缺乏对Alb片段导致UAlb检测结果影响的分析。其次，方法学上，没有认可的UAlb常规免疫学测定方法[9]。体积排阻色谱法(size–exclusion–high–performance liquid chromatography，SE–HPLC)虽可检测出尿中Alb片段，但仪器成本高，技术难度大，且难与同体积小分子蛋白区分，导致高估一些UAlb检测结果[10]。此外，样本的选择、报告方式以及判定值设定等方面均可能影响UAlb检测结果[11]。

(一)分析前变异

1．生理变化：

个体生物学差异可致UAlb排泄率4%～103%的变化[3]。

2．样本收集与贮存：

(1)容器影响：Alb易吸附在塑料容器表面，导致UAlb检测结果偏低。(2)贮存影响：不同温度下，UAlb稳定性不同。(3)防腐剂影响：防腐剂的应用缺乏统一规定，不同临床实验室对其选择可能不同。

UAlb分子的存在形式及免疫反应性：尿中Alb分子因化学修饰和(或)酶降解等生化作用，常以多种结构形式存在于尿液[9]。不同的检测方法所检测的Alb分子片段不尽相同，致使检测结果迥异(表1)。

表1

除上述客观条件的影响外，人UAlb的排出量至少还受以下因素的影响：体位、运动、血压、蛋白摄入量、体温、情绪及药物(青霉素、心痛定、乙酰水杨酸、去甲肾上腺素)等可致UAlb浓度升高[12]。

（二）、检测方法变异

1．临床实验室检测：

临床实验室检测UAlb的方法有免疫学法和色谱法两大类，免疫学法只能检测具有免疫反应性的UAlb，且其相对分子质量>12 000；但是，当血中Alb流经肾脏时，受溶酶体酶的作用，>99%被生化修饰，形成分子大小不等的Alb衍生片段。SE–HPLC是一种主要以分子体积大小来进行分离的方法，能同时检测具有免疫反应性和非免疫反应性的UAlb。

目前UAlb定量尚无决定性方法，候选方法有SE–HPLC，液相色谱串联质谱法(liguid chromatography–tandem mass spectrometry，LC–MS/MS)等。该法只能检测带N末端的UAlb，不能检测所有Alb片段。此外，由于受高信噪比影响，UAlb<20 mg/L时，结果可靠性差。利用同位素稀释质谱和多反应监测技术，有学者建立了稳定同位素稀释多反应监测质谱之UAlb绝对定量方法[13]。该法用15N同位素标记的全长重组人血清Alb作内标，利用该内标与被测UAlb有相同或相近的理化性质，使二者充分混合，其比值基本不受其他因素的影响，从而达到UAlb绝对定量的目的。不过，操作耗时，仪器昂贵，使许多实验室可望而不可及。

2．POCT检测：

近年来，发展了床旁检验(point–of–care test，POCT)来筛查有肾病风险的高危人群。一个系统回顾和荟萃分析显示[14]：半定量和定量检测的阴性似然比分别为0.26(95%CI，0.16～0.40)和0.04(95%CI，0.01～0.25)。可见，半定量POCT检测阴性结果不能排除白蛋白尿[15]，定量POCT检测虽可用于排除白蛋白尿，但所设定的判断线均为30 mg/g(3.4 mg/mmol)，不满足美国国家肾脏基金会(National Kidney Founclation，NKF)和FDA<10 mg/d(或Alb mg/g Cr)之要求。

3．实验室间的变异：

用多克隆抗体能与一些降解的Alb和其碎片发生反应，而单克隆抗体则可能因Alb分子降解或断裂导致某些非特异性结合抗原位点不被检测。由于不同实验室采用的检测方法不同，导致尿Alb的检测结果有所不同，甚至完全没有可比性。

（三）、参考区间问题

白蛋白尿起源于对糖尿病患者肾功能损伤的研究，其参考值上线为30～300 mg/24 h，或在30～300 mg/g (UAlb/Cr)。美国糖尿病学会就建议将筛查心血管风险患者肾功能损伤的UAlb降为20 μg/min[16]。对中国人口的研究发现，ACR正常上限男性低于女性，分别为14 mg/g和20 mg/g。年龄、血压和eGFR均与ACR值相关。此外，参考区间的确定与检测方法有关。比如，SCr现多用肌氨酸氧化酶法检测，而非制定参考值上线时所用的Jaffe's动力学法。

（四）、报告单位问题

UAlb定量通常以单位时间(多用24 h)内Alb的排泄量(AER)来表示，AER是检测UAlb的"金标准"，结果较ACR可靠[17]。但收集24 h尿样困难，因此许多国家指南和文献推荐使用不定时尿液，以白蛋白肌酐比(ACR)报告。大量研究表明，无论定时尿还是随机尿，ACR与AER均高度相关[18]。

根据习惯和检测方法不同，尿Alb检测的报告单位截然不同，总体显得混乱，容易引起混淆。尿Alb检测常见报告单位有："mg/L"、"μg/L"、"μg/ml"、"mg/min"、"mg/h"或"g/24 h"；尿ACR常见报告单位有："mg/mmol Cr"、"g/mol Cr"、"mg/g Cr"或"mg/mg Cr"。这种现况反映了某个国家或地区习惯问题，且难于统一。

二、尿白蛋白检测的解决方案

(一)样本采集与处理

1．容器的选择：

塑料会吸附Alb，导致低浓度UAlb样本的检测结果偏低。因此，用塑料容器盛装尿样时，应留取足够体积量，以降低UAlb的相对损失。
因为塑料会吸附Alb，所以应避免使用未经处理的塑料容器盛装尿样本。

2．样本贮存与转运：

尿液留取后应立即送检，2 h内完成检测。若不能即时检测，可按下述方式保存和转运。(1)IFCC工作组提出的贮存温度影响[3]：–80℃冰冻可长期保存；高于–80℃，尤其在–20℃，可形成变异体；2～8℃，可稳定7 d。(2) WHO推荐(WHO/DIL/LAB/99.1 Rev.2)：4～8℃，稳定1个月；20～25℃，稳定7 d。WHO与IFCC提出的存储温度影响有较大不同，最好参照IFCC提出的贮存温度影响。(3)无冷藏条件时，可加0.1%叠氮钠或1.0 g/L硼酸防腐。(4)样本运送应密闭，并防止高温和阳光直射。

(二)试剂选择

免疫学法是UAlb临床实验室常规检测方法。由于Alb分子有多个抗原结合位点[2]，所以，方法学选择时应挑选多克隆抗血清试剂盒，以尽可能检测降解后的Alb分子片段，从而提高检测的敏感度和阳性率，避免漏检。

(三)方法敏感度

2009年，由美国NKF和FDA发起研讨会[15]，将UAlb参考区间作了调整，由原<30 mg/d(或Alb mg/g Cr)降为<10 mg/d(或Alb mg/g Cr)。该参考值的改变表明NKF和FDA对有肾病高风险的人群更加关注，也表明肾功能的损伤出现在30 mg/d(或Alb mg/g Cr)之前。这就要求所选用的UAlb检测方法，其检测敏感度必须<10 mg/L。

三、我国现状与展望

迄今为止，我国尚未颁布UAlb检测统一指南。目前国内多用免疫透射比浊法检测UAlb，部分方法所用参考物质可溯源至ERM–DA 470/IFCC，部分方法之检测结果可靠性还有待改善[19]。实验室检测方面，LC–MS/MS和SID–MRM–MS测定UAlb的方法日趋成熟，为UAlb参考方法的确定奠定了基础。

参考文献
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