尿白蛋白检测标准化进展及实验室应注意的问题

岳光

作者：郭玮 潘柏申
单位：复旦大学附属中山医院检验科

生理状态下，血浆中的部分白蛋白可从肾小球基底膜滤过进入原尿，其中95%在近曲小管被重吸收，仅有少量从尿液中排出；当肾小球基底膜的物理或电荷屏障出现异常时，尿液中的白蛋白排泄量即可增加。20世纪60年代，Keen和Chlouverakis[1]研究了糖尿病患者中尿白蛋白的排泄情况，由于当时常规的检测方法无法检测到尿液中略微超过正常排泄量的白蛋白，因此将其命名为"尿微量白蛋白"[2]。

随着检测技术的不断提高，临床实验室已经可以定量测定尿液中的白蛋白；同时大量临床研究也提示尿白蛋白对于终末期肾病(end–stage renal disease，ESRD)及心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)风险的预测是连续性的[3]，因此国际相关领域专家建议规范名称为"尿白蛋白"，不再使用"尿微量白蛋白"[4]；2012年改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease: Improving Global Outcomes, KDIGO)颁布的《慢性肾脏疾病评估与管理临床实践指南》[5]对慢性肾病分期的指标进行修订，将原来仅依据肾小球滤率(glomerular filtration rate GFR)，改为依据肾病病因(cause)、GFR和白蛋白尿水平(albuminuria)的CGA联合应用，以期更科学分期、更有利于慢性肾病的诊疗。

尿白蛋白排泄量增高常常是伴随糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)发生的第一个临床指标，在此阶段给予肾素–血管紧张素–醛固酮系统抑制剂治疗可以有效延缓DKD向ESRD进展。2002年至今，已有多个国家及国际组织颁布的关于慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)的临床实践指南或与DKD相关的临床实践指南中都将尿白蛋白作为重要的检测指标之一[4,5,6]。

尿白蛋白检测除用于CKD与DKD的诊断和治疗监测外，也可作为心血管疾病及全因死亡的危险预测指标，得到了临床的广泛使用；但需注意，当DKD患者进展到大量蛋白尿阶段，或者以大量蛋白尿起病的肾脏疾病患者，应直接检测尿总蛋白，无需检测尿白蛋白。

临床检验工作人员除了了解尿白蛋白检测的临床应用价值外，还应了解尿白蛋白检测中的一些问题，包括检测标准化、标本的留取及报告方式以及决定水平等，才能更好地指导患者正确的留取标本，并协助临床对检测结果做出合理解释。

一、尿白蛋白检测标准化

尿液中除具有完整分子结构的白蛋白外，还存在被蛋白酶水解白蛋白碎片以及被离子修饰发生化学变性的多聚体[7]。完整的白蛋白分子具有5个抗原表位，而被修饰的白蛋白及白蛋白碎片往往会失去部分或全部免疫原性，因此，目前临床实验室最为常用的免疫比浊法(散射法或透射法)无法完全检出这部分白蛋白，对临床患者尿白蛋白的排泄量存在一定程度低估。2009年Clinical Chemistry就提出免疫检测法对尿白蛋白的检出限具有局限性[5]。

目前不同试剂厂商的尿白蛋白检测结果间存在较大差异，Bachmann等[8]比较了16种常用检测方法间的偏倚情况，以同位素稀释质谱法作为参考方法，结果显示在30 mg/g决定水平浓度时各方法与参考方法间的偏倚超过±10%，不同浓度偏倚中位数更达到了40%左右。

2009年，美国肾脏病协会(American Society of Nephrology，ASN)的肾脏病教育计划(The National Kidney Disease Education Program，NEKDP)及国际临床化学协会(International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine，IFCC)联合启动了尿白蛋白检测标准化计划。目前该计划取得的进展包括候选参考物质和候选参考测量程序的确定[9]。

候选参考物质包括：IFCC研发的ERM–DA470/ERM–DA470K、国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)研发的纯化人血清白蛋白SRM 2925、以及Mayo Clinic基于SRM 2925研发的15N标记的纯化人血清白蛋白。虽然目前大部分厂商尿白蛋白检测试剂都声称溯源至ERM–DA470/ERM–DA470K，但由于ERM–DA470/ERM–DA470K为人混合血浆蛋白，血浆白蛋白浓度与尿白蛋白浓度存在几千倍的差异，不同的稀释方案和稀释介质会都对检测结果产生显著影响。SRM 2925的浓度为1 g/L左右，减少了大比例稀释引入的误差。15N标记的纯化人血清白蛋白片段可用于高效液相色谱串联质谱(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC–MS/MS)检测，目前NIST正在寻求商业化实验室评估生产程序，以期开发商业化产品[9]。

候选参考测量程序由Mayo Clinic Renal Function Laboratory实验室研发，将白蛋白经胰蛋白酶消化后，使用LC–MS/MS进行检测，对3条肽链的检测结果都显示了良好的批间重复性和回收率；并方法可以检测到尿液中分子结果不完整的白蛋白。目前NIST正在对该方法进行验证和完善，包括在其他质谱分析系统上进行验证，并增加8条肽链的检测等。

在尿白蛋白检测标准化尚未实现的现状下，临床试验室在使用免疫比浊法检测试剂时，应选择使用多克隆抗体的检测试剂，并建议患者在同一家实验室进行随访，以保证检测结果前后的可比性。

二、实验室应注意的问题

1．尿液标本留取类型及方式：

用于尿白蛋白检测的标本包括时段尿(如24 h尿、12 h尿)、晨尿、随机尿。生理状态下，尿白蛋白的排泄受到饮水量、运动、体位、饮食等多种因素的影响，文献[10]报道的个体内尿白蛋白排泄的变异可高达95%。由于24 h尿液标本可较好地消除个体内一天内不同时段生理变异因素的影响，因而一直被视为尿白蛋白检测标本的"金标准"。但是24 h尿液标本的准确留取并不方便，患者依从性并不好，很难在临床大规模开展监测与筛查时使用。

考虑到标本留取的便利性，随机尿仍是临床最常用的检测标本类型。但由于个体内变异较大，随机尿白蛋白检测通常用尿肌酐进行校正。

晨尿是临床较为常用的一种标本类型，相比于随机尿受到饮水和生理活动的影响较小。但对于夜尿增多的患者，晨尿的生理变异仍较大。本实验室在对糖尿病患者的研究[11]发现，夜间12 h尿白蛋白与肌酐比值与24 h尿白蛋白排泄量相关性最好，优于晨尿和随机尿。夜间12 h尿标本类型的临床适用性仍需进一步评估，目前尚无指南推荐。

2．报告方式：

尿白蛋白检测报告方式主要有：尿白蛋白浓度(urinary albumin concentration, UAC)(单位mg/L)；24 h尿白蛋白排泄率Urinary albumin excretion rate UAER(单位mg/24 h)；每分钟排泄率(单位为μg/min)，以及尿白蛋白与肌酐比值(albumin–creatinine ratio, ACR) (单位mg/mmol、mg/g或μg/mg)等[12]。目前24 h UAER仍是检测尿白蛋白的金标准。但鉴于标本留取的方便性，临床上多采用晨尿或随机尿ACR。以ACR来反映白蛋白排泄情况，可使个体内变异减少到38.6%[10]。ACR是目前各种糖尿病及慢性肾脏疾病防治临床指南普遍推荐使用的报告方式，但是单次检测结果异常并不能诊断CKD。2007年《K/DOQI糖尿病和慢性肾脏病的临床诊疗指南》[13]推荐3～6个月内至少采集3次标本，有2次以上的ACR检测结果>30 mg/g方可诊断CKD。2013年KDIGO推荐使用晨尿ACR,建议在随机尿ACR检测大于30 mg/g的情况下需检测晨尿标本ACR进行确定[12]。

3．判断值的设定：

自1999年美国糖尿病协会(American Diabetes Association，ADA)[14]将24 h尿白蛋白>30 mg/24 h，随机尿ACR>30 mg/g定义为白尿以来，ACR>30 mg/g一直被作为DKD的诊断切点值。但不同年龄、性别、种族人群的尿肌酐排泄量存在差异，尿肌酐排泄量较低的人群(如女性)ACR检测结果异常的发生率会偏高，近年来有研究者提出了针对不同性别采用不同的决定水平(女性>20 mg/g，男性>30 mg/g)[15]。ACR生理学变异相对较大，单一决定水平确实会给临床判断带来困扰[5]。使用不同的决定水平(例如诊断决定水平和排除决定水平)可以为临床提供更多更科学的信息。2009年本实验室做了这方面的研究，联合应用诊断决定水平和排除决定水平可以提高ACR对早期糖尿病患者肾脏损伤诊断的敏感度与特异度，部分降低了ACR个体内变异对诊断性能的影响[8]。

2010年一项研究[16]报道了GFR正常的人群中，ACR 10～29 mg/g的个体较ACR<10 mg/g的个人，全因死亡和心血管疾病死亡风险都更大，ACR>10 mg/g与估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)<60 ml/min/1.73 m2是全人群中独立的死亡风险预测指标。

KDIGO 2012指南中仍使用ACR>30 mg/g(24 h尿白蛋白排泄量>30 mg)作为肾损伤的判断指标之一，并将ACR<30 mg/g定义为尿白蛋白排泄正常至轻度增加，30～300 mg/g定义为中度增加，>300 mg/g定义为重度增加，与eGFR、病因一起用于CKD的分期与预后分层。对不同人群、不同肾脏疾病的临床诊断以及风险预测中是否需要建立特异的ACR判断水平，仍需要更多的大规模临床研究进行评估。

尿蛋白检测具有重要的临床应用价值，检验专业人员应该予以重视，认真研究为临床提供更多准确、可靠的检测结果，为肾脏疾病的临床诊疗提供更有价值的信息。鉴于尿白蛋白检测在临床诊疗中的重要性，应尽快建立适合我国国情的临床实践指南，文中所探讨的尿白蛋白标本的留取方式、检测的标准化、以及判断值的设定可能对此有所帮助。

参考文献
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