精液检测急待解决的问题

岚峰pisces

作者：中日友好医院  曹兴午教授
        中国中医药研究促进会与中日友好医院共同举办《2014年生殖医学论坛》精英荟萃、人才济济，畅所欲言、热烈发言。个人立论实践所观察的经验，通过缜密思考，提出以论据为支撑点的学术观点，甚至问题，流于笔尖、发于肺腑。是资源共享的一种丰富交流活动，真是不虚此行。
        凡是科学取得成就的单位，凡是人才辈出的地方，必然是科学文化盛行，科学土壤肥沃，科学气氛浓厚，科学讨论热烈，科学思维活跃的殿堂，这是时代的需要，科学发展的需要，医患沟通的需要，是创新时代的需要。
        会上，三甲医院一位资深学者的发言，生动活泼，导出了心声与困惑，笔者深深感动、心灵碰撞，本文就其发言内容归纳并提出建议：
        一、一线男科主任医师的困惑与期望——临床医生对实验诊断学的批评与要求
        1.男科学的实验结果对临床医生非常困惑，如前列腺液、生殖激素的检测的不确定性。
        2.精液分析结果让临床医生很不省心，参差不齐、前后不同、标准不一、各行其是。
        3．精液细胞学检测不准确：精液内的主要细胞——白细胞、生殖细胞
        （1）精液中白细胞：精液内出现的细胞为炎性指征，可能是炎症=病原体感染，临床以病原体感染=细菌存在=需要抗生素治疗。如果将生殖细胞错误报告白细胞，最终是导致误诊，不能给患者解决问题且造成伤害，造成医患矛盾。为此，精液细胞学的鉴别分类非常重要。
        （2）精液生精细胞的检测有重要意义 ：精液中生精细胞包括：①精原细胞；②初级精母细胞；③次级精母细胞；④精子细胞。能有效地鉴别精液中细胞的性质，应该是对检验人员的基本要求，区分白细胞与生精细胞是检验人员必须的责任。根据精液生精细胞分类的动态观察，精液生精细胞的变化，可作为疗效观察和判断预后的指标之一，例如细胞毒类药物、温度等因素对生精细胞的影响。 总之明确区分炎症细胞与生殖细胞，在治疗上起到关键作用：一旦诊断为炎症细胞，需要了解是否存在感染的病原体；一旦诊断为生殖细胞，需要分析其主体细胞是什么?考虑睾丸功能。
        4．医生对精子形态结果的困惑：（1）精子形态带给医生的困扰最大！（2）如何再认识精子形态分类？正常与异常？（3）各种形态特征说明了什么？（4）形态学传统标准、现代标准的结果怎么选择应用？怎么面对患者的各种困惑与解读？（5）结论：WHO-5版的形态标准到底有什么意义？
        5．一线男科医生的渴望与期待：（1）能否让检测结果更准确地反应患者的真实情况？！（2）在取精出现各种干扰情况下，例如取精间隔时间、取精方式、身体健康状况、情绪等因素下的精液常规分析结果的矫正参考值？！（3）实验诊断能否出现一个针对男性生育能力的综合评分，来全面评估男性不育症的生育潜能及预后？！（4）最终医生需要了解的是：通过实验诊断结果，医生需要了解是反应患者的生育潜能定级:① 很好 ②一般③很差④极差，这些就足够了，把复杂的分析数据简单化便于临床解读。笔者就以上问题进行建议：  
        二、建立精液病理学实验室迫在眉睫
        精液病理学已经成为当今男科实验诊断学中不可缺少的重要手段，是男科学中的一个分支学科。广义的精液病理学，包括：精子动力学、精子功能学、精子形态学、精液生精细胞学、精液生物化学、精液细菌学、精液免疫学、生殖激素等内容；狭义的精液病理学包括：精子动力学、精子形态学和生精细胞学，主要以精子动力学和形态学为基础和依据，可称“精子动力学和精液脱落细胞学”。目前，临床实践中绝大多数医院的精液检测报告仅有精子数量、精子动力学和精子计数仪（CASA）测定的结果，而且，依精子活体进行形态分类，这样的结果已经严重阻碍男科学的迅猛发展[1]，实验室的检测结果远远不能满足临床诊断和治疗的需要，现实的检查结果也不能长期处于“灰色地带”，应该尽快、尽可能提供临床以明确诊断和治疗依据的检测结果。实验室与临床必须密切合作，是转化医学的具体体现，必须提高男科学基础研究的整体水平，因为基础研究决定临床研究的高度，基础研究的提高，进一步促进临床科学研究的发展，是提高男科诊疗水平和促进男科学发展的必经之路。诸多医生都忙于应付临床病人的医疗，研究工作显得没有深入和创新，仍然是简单重复，缺乏长期、整体、深入的科研系统规划，尤其是基础研究更显滞后，关乎百年大计，切切不可忽视。
        三、精液病理学检测的目的与责任
        （一） 评估睾丸生殖功能与性功能，是观察和维护男性生育力和性能力的重要指标[2]。
        （二） 尽可能寻找、确定造成睾丸生精障碍的病因或指出造成睾丸损伤的可能性，为临床提供诊疗的可行性依据[3]。
        （三） 依精液检测内容与结果，尽可能挖掘引起不育症的病因学依据，如精索静脉曲张的手术指征和手术后疗效的评估[4]，又如腮腺炎迁延性对睾丸损伤的评估与预测[5]，微生物感染对睾丸损伤的提示[6]，生活因素[7]与环境有害因素对生殖健康的影响与预防（尼古丁效应精子的检出）[8]，雄激素缺乏的提示（幼稚精子的检出）[1]，以及药物疗效的观察指标和药后效应的预测。
        （四） 依据精液脱落细胞学检测结果，确定双方存在的病理性因素，如线索细胞检出，说明加德纳菌感染[9]。
        （五） 依据精液脱落细胞学检测结果，作为观察与判断疗效的指标[10]。
        （六） 依据精浆生化指标、免疫指标，确定病因、考核疗效。
        （七） 依据精液脱落细胞学检测结果，为治疗不育症提供靶向定位治疗的新理论依据，睾丸生殖功能障碍的靶区、靶细胞、靶点[11]。
        （八） 依据精液脱落细胞学检测结果，观察和研究男性的性功能水平，创建性学研究进入微观世界的创举，作为预测部分雄激素缺乏综合症的指标，开创世界中医药汉方时代性学研究的理论与实用的先河[12-13]。
        四、精液病理学检测的内容
        （一）精液理学与动力学内容：提供精液的基本信息，为寻觅病因提供分析线索。
        （二）精子形态学分类：无论自由分类、严格分类，都应该以确定病因和评估男性生育力为目的。根据我国不育症患病现状与发展趋势，应以确定病因、预防不育症的发生比评定正常精子更为重要。
        （三）精液脱落细胞学内容[1]
        精液中有形成分是睾丸的代谢产物，是反映睾丸生殖功能的具体表现，应进行染色检查，其检出内容应包括：①睾丸生殖系统：间质细胞、支持细胞、生精细胞（精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞）和精子、支持细胞骨架、微管、微丝；②血细胞系统：中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、异常淋巴细胞、红细胞；③生殖道上皮系统：前列腺上皮、精囊上皮、附睾上皮、尿道上皮、肾上皮、阴道上皮（来自女性）；④睾丸与前列腺结晶：如含铁血黄素结晶、精胺酸结晶、前列腺结石；⑤微生物：细菌与菌沙、加德纳菌、线索细胞、病毒脂质体和包涵体；⑥其他有形成分：颗粒残渣、脂滴、组织纤维等。总之，精液中的有形成分都可以考证睾丸的生殖功能状态和病理性损伤的程度，为此，不应轻视任何精液内容，都应该是检出作为观察的指标，尤其生精细胞凋亡的检测已经应用[14]，我们必须认真检测与辨识，提高实验诊断水平，为临床提供有利的诊断和治疗依据。
        五、回复一线医生的困惑与解读
        1.精液中圆形细胞检测与分析
        （1）白细胞的检测方法问题：WHO手册一直采用“圆形细胞”，实际上是指所有细胞，没有要求辨认细胞分类，这是缺乏负责任的提法，作为世界级的手册，恐怕考虑欠妥。为此常年误报“白细胞”造成误诊误治。此外，如果报告白细胞也要染色鉴别进行分类。黄宇烽对50名男性精液同时进行直接涂片和染色后镜检比较，结果直接镜检96%检出白细胞（48/50）而染色镜检仅为16%（8/50）。认为：染色后能够准确低识别白细胞，因此精液白细胞必须用染色方法鉴别。
        （2）精液中白细胞检出率观察：曹兴午（1992）对42例精液新鲜标本高倍镜检与瑞-姬染色比较，新鲜精液白细胞检出率100%（42/42）,染色法检出率24%（10/42）。其中9例为＜5个，1例＞5。说明鉴别后精液中大部分不是白细胞。1990年对95例生育组（n=30）与不育症(n=65)精液中白细胞瑞-姬染色油镜观察（白细胞/400油镜）,生育组为13.3%（4/30）；不育症为13.8%（9/65）两组无显著差异。2005年对293例不育症精液中白细胞检出率为46.9%（136/293）。 2006年对136例白细胞数量分布研究，以白细胞/400视野油镜观察结果：≤5个为70.6%(96/136) ;＞6个为29.4%（40/136），大于40个白细胞只有1例。可见在不育症患者的精液中，仅有少量白细胞存在，白细胞脓精症为极少。如果有大量白细胞者出现，一定检测前列腺液。
        （3）精液中可见非生殖细胞分类：以中性粒细胞最常见约为60%~80%，其次为巨噬细胞，约占炎性细胞的20%~30%，淋巴细胞约占3%~10%，偶尔见到嗜酸细胞。
        （4）生精小管内细胞转化（cellular transform）:界膜中有单核细胞，在一定条件下转化为巨噬细胞，其在传递和处理抗原方面起重要作用，在免疫性炎性反应中起重要作用。睾丸炎可见巨噬细胞通过界膜进入生精小管官腔。可随精液排出，精液可检测巨噬细胞。
        巨噬细胞：为免疫功能细胞。睾丸内每10~50个间质细胞含有1个巨噬细胞。平均40个计算，在200×10^6个间质细胞中，大约含有5×10^6的巨噬细胞。成人睾丸间质细胞中有25%为巨噬细胞。巨噬细胞可通过分泌细胞因子影响间质细胞功能，特别是增殖、分化及类固醇激素的产生。巨噬细胞分泌刺激和抑制类固醇形成的物质。致炎性细胞因子、活性氧、一氧化氮（NO）及前列腺素类等物质均可抑制间质细胞的功能，导致间质细胞分泌功能减弱，引起睾丸发生一系列病理性改变。这类细胞过多出现活化（activation），可以吞噬精子，直接反映了睾丸免疫功能活化。
        淋巴细胞：在严重生精障碍的生精小管的睾丸活检中有淋巴细胞包绕。在腮腺炎中有35%的病例伴随有严重的睾丸炎性反应。吴明章报告：在原因不明男性不育症与支原体阳性不育症的精液中，非生精细胞成分均有增加，与正常生育者精液比较，不育症者的精液中非生精细胞总量为正常生育组的3.7倍、其中白细胞增加5.6倍，多形核白细胞增加4.6倍，淋巴细胞增加11.3倍，主要增加是CD4淋巴细胞细。笔者观察到，在病毒性感染精液中，发现吞噬细胞（巨噬细胞）的骨架中可以观察到病毒颗粒。对于检出非生精细胞的精液，需要进行相应进一步的检测，特别注意免疫功能与病毒性感染的可能。说明区分圆形细胞的必要性与重要性。
        2．生精细胞的细胞生物学
        （1）精原细胞：精原细胞位于生精上皮基膜。分A型B型两大类，从生理角度将A型精原细胞分两型：Ad(暗型)与Ap(亮型)。
        Ad型精原细胞（睾丸干细胞，很少分裂）：在正常环境这没有增殖活动，只有在非正常情况下才进行分裂，换句话正常情况不分裂，只有有害因素影响下，精原细胞急剧减少时，才进行有丝分裂。这型精原细胞代表了睾丸干细胞。研究表明只有A型精原细胞是精原干细胞（SSCS）。为此，研究SSCS增殖和分化的机制已经成为生殖领域的重要课题，是深入揭示精子发生机制和诊断治疗男性不育症的重要途径。
        Ap(亮型)精原细胞（精子的始祖细胞，可以自我更新）：可分裂、自我更新，分化成两个B型精原细胞。B型精原细胞直接分化为前线期（休止期）精母细胞。以后生精细胞开始DNA合成，精母细胞逐渐分化发育，通过细胞间桥联系和生殖发育。
        （2）初级精母细胞：由B型精原细胞分裂形成的初级精母细胞处于分裂期，称细线前期精母细胞与B型精原细胞相似。此期停留时间很短，立即进入分裂期，此期的初级精母细胞内部细胞器增多，高尔基复合体发达，线粒体逐渐形成泡状线粒体，细胞质密度高于精原细胞。根据组织学的形态特征，可分细线期、偶线期、粗线期（可有早期、中期、晚期粗线期精母细胞形态特征，其特点是密集的RNA合成。）、双线期和终变期。发育时间为22天。
        （3）次级精母细胞：初级精母细胞完成第一次减数分裂，形成两个体积较小的次级精母细胞。靠近管腔，具有均质状圆形核，常常两个核者多见，染色质呈细网状，并有一些大而深染的环形块。次级精母细胞发育为一天，常常不易看到。如果出现过多，可根据时效性判断睾丸损伤程度。
        （4）精子细胞：次级精母细胞完成第二次减数分裂，形成精子细胞。根据形态学可有圆形精子细胞和长形精子细胞。精子细胞经过核浓缩、核蛋白转型、顶体形成、尾部形成、剩余胞质丢失等有序变化，形成精子，称精子变形。根据形态特征，可将精子形成分成4个时期，即高尔基体期、头帽期、顶体期、成熟期。
        成熟期最重要的事件是剩余的细胞质即残体的排出。残体被支持细胞吞噬，而且具有调节功能。拉长的精子细胞和残体影响支持细胞的分泌功能，如产生生精小管液、分泌抑制素（INH）、雄激素结合蛋白（ABP）、IL-1、IL-6。伴随着残体的降解，一个新的生精周期开始。如果睾丸生精障碍发生在精子细胞的成熟期，必然导致支持细胞吞噬功能减弱、分泌功能减弱等一系列病理现象出现，致生精生成减少的后果。
        近年在基因敲除以及高通量技术的研究，逐渐在分子生物学水平揭示精子变形机制，特异性基因/蛋白质及其之间的相互作用，用以证实参与精子变形的各个生物学事件。
        （5）精子：人类生精细胞的数量由每个支持细胞上相对应的精子数目决定的。换句话说产生精子数量越多，说明生精细胞越多并功能良好。健康人24小时内每克睾丸组织产生精子的数量为3~7百万/克。过去研究认为，在生精细胞减数分裂的过程中，有50%的生精细胞丢失，为此，认为人类精子发生过程效率很低。经三维技术研究证实，没有检测到减数分裂期生精细胞丢失的现象。采用流式细胞仪定量检测，获得同样的结果，为此证实，人类精子发生的效率比以前报道的要高。
        近年对精子功能的研究，已经采用高通路的转录组以及蛋白质组学技术，应用于精子功能及调控的研究，将全面揭示精子功能提供了基础。
        3.支持细胞的细胞生物学概述
        （1）支持细胞生精上皮内的体细胞：支持细胞占生精上皮容量的35%~40%。正常生精功能完整的睾丸内含有800~1200×10^6个支持细胞，睾丸组织每一克有25×10^6支持细胞。
        支持细胞位于基膜，向生精小管管腔延伸，细胞质突起分支。是生精上皮的支持结构。生精细胞沿细胞质一直向管腔延伸，侧面与腔面伸出许多不规则的突起，生殖细胞发育成熟以致精子发生都镶嵌在上面。支持细胞的特殊的细胞质结构，成为精子定向分化过程的基础。支持细胞分泌蛋白质类、细胞因子、生长因子、类罂粟碱、前列腺素、细胞分裂调节因子等。
        （2）支持细胞形态的生理功能：细胞质含有滑面内质网，主要是合成类固醇；粗面内质网主要合成蛋白质；高尔基体，主要是内分泌产物的包装与转运；溶酶体系统（颗粒），主要是溶解蛋白等残余物并进行吞噬作用，与支持细胞降解和处理精子残余细胞质的功能相关；细胞膜含有微丝、微管和中间纤维，是支持细胞的骨架，主要以不同细胞的形态特征，来适应生殖细胞的发育与成熟作用的不同阶段，是形态改变的基础，其改变反映了支持细胞的功能状态，；肌动蛋白，主要是细胞蠕动、游走、定向运动的功能蛋白，一旦肌动蛋白失去作用，细胞就处于瘫痪、萎缩、退化和停止发育状态时。对生殖细胞和精子成熟起不到相互调控作用，可导致睾丸生殖功能障碍。
        （3）支持细胞与睾丸容积与生殖细胞和精子生成关系密切：每个支持细胞在形态学及功能上与一定数量精子的产生相联系。人类每个支持细胞对应10个生殖细胞或1.5个精子。由此看来，假如所有支持细胞功能都正常，支持细胞越多，产生精子的数目就越多，睾丸的体积也就越大。相反支持细胞不正常，支持细胞就会萎缩幼稚化，那么，生殖细胞的数目和产生精子的数目就效应地会减少，睾丸的体积也就会相应缩小、高度降低。流式细胞仪证实：睾丸体积大小主要是生殖细胞的输出总数决定的，而生殖细胞的多寡和生理状态都是与支持细胞的功能密切相关。
        （4）支持细胞的标示物与雄激素：标示物有：转铁蛋白、雄激素结合蛋白、连接蛋白有N-钙-黏蛋白和连接蛋白43，其是一种间隙连接蛋白，如果缺乏该将导致支持细胞发育不成熟，进而造成阻碍精原干细胞的分化，致生精阻滞，闭合素、睾丸蛋白、结合素、斑蛋白和钮蛋白，它们的分泌与表达必须依赖于雄激素出现变化。这些成分不仅与血睾屏障有关，而且与精子释放以后支持细胞、生殖细胞连接的重塑有关。
        （5）支持细胞的分泌液：支持细胞细胞质的的分泌液，除一部分为生殖细胞吸收利用外，90%流入生精小管，创造和维持生精小管管腔的开放性。血睾屏障是特殊的结构，防止分泌液的吸收，维持了管腔开发所需的压力（睾丸维持高渗透压状态）。
        结语：一个学术思想、理念，甚至是推测，一开始不可能十全十美。它需要在不断实践中摸索、探求，不断在“动荡”中，认识不足，甚或错误，修正自己的认识，继续前行日臻完善，享受过程是科学工作者的成长、锻炼和执着追求的品质，结果可能与探索吻合，更可能是一个教训，哪一种结果都是财富。科学研究永远在路上，科学工作者应该具有一生努力的精神。科学研究必为互相借鉴，取长补短，启迪思路，为新的科研路径设计方向。不断借鉴、不断推进、不断创新，是科研的灵魂和生命力。
        参考文献略