关于UF

岚峰pisces

                                                          冈田弘*1，堀江重郎*1，井上淳也*2，河岛康之*2
                                        *1东京大学医学部泌尿器科学教室  *2 希森美康株式会社诊断药开发本部
概述
       伴随着尿液检验的自动化，对检验的实质性提高和检验速度提出了越来越高的要求。2005年，发表了“临床检验的指导方针2005/2006”，临床医学检验的标准化在不断取得进展。本次发售的UF-1000i 型全自动尿中有形成分分析装置不仅推进了尿液检验的自动化，而且是与上述政策中的一项指导方针、即尿路感染症（UTI）诊断指导方针对应的以支持诊断为目的的装置。这一次，我们使用UF-1000i，就泌尿科患者尿样本中的白细胞和细菌的检测进行了基本性能方面的评价研讨。UF-1000i能够对白细胞数和细菌数迅速计数，作为尿路感染症诊断指标，是可以在临床诊断上发挥作用的装置。
       关键词：UF-1000i，流式细胞测量法，FCM，脓尿，细菌尿，尿路感染症，UTI。

前言
       虽然尿路感染症（Urinary Tract Infection;UTI）在临床上是一种常见的疾病之一，但是，如果诊断延误，甚至有导致败血症的可能，迅速诊断、治疗是很重要的。近年来，引入了以检验的标准化和控制医疗费用为目的的总体医疗思想，发表了以推进适正检验为目的的“临床检验的指导方针”。其中，UTI的诊断有必要以排尿痛和尿频等的临床症状为契机，通过尿检证明有意义的脓尿[用非离心尿的计算法（chamber method）获得的白细胞数（WBC）≥10/μL或者用尿沉渣法获得的WBC≥5 个/HPL和有意义的细菌（尿培养法细菌数≥10∧4 CFU / mL）的存在1）。
       现在的尿中细菌数的确认方法是用定量白金耳在菌落数确认用的琼脂培养基上涂一定量的尿，经过一昼夜或者至第二天培养，然后根据培养结果来进行判断，无法做到迅速诊断2）。显微镜下确认细菌存在的革蓝氏染色法不需要培养操作，能够迅速获得有无细菌的判断结果，是有用的确认方法。但是，这种方法受到操作者技术水平的制约，而且如果样本中菌数少，则有漏检的可能2，3）。这一次，我们获得了评价希森美康株式会社新开发的UF-1000i型全自动尿中有形成分分析装置（以后简称为UF-1000i）的机会。UF-1000i采用对尿中的红细胞、白细胞、细菌等细胞成分进行核酸荧光染色并迅速检测的流式细胞测量法。特别值得一提的是，因为UF-1000i中配置了细菌检测用的专用通道，所以能够高精度检测微小细菌并计数。具体说来，就是为了给细菌进行特异性染色，做了以下特别设计：对于染色液，组成中使用了与菌体内的核酸成分结合的希森美康独有的荧光色素。对于稀释液，改进了试剂的组成，使原来与微小细菌难以辨别的尿中微小粘液成分和尿中细胞的微小片断等所谓的“夹杂物”的影响减轻。
       为了评判UF-1000i 在临床应用上能否在UTI 的迅速判断上发挥作用，我们使用了本院泌尿科的患者样本，以检测性能的评估为中心进行了基础性研讨，本文为报告研讨的结果。
检测原理
       与现有的“UF-100”和“UF-100i”、“UF-50”一样，UF-1000i的基本原理采用的是流式细胞测量法。
       作为现有装置的代表，UF-100采用了氩离子激光（波长λ=488nm）。为了达到更加小型化和节省电力的目的，UF-1000i 采用了红色半导体激光（波长λ=635nm）（图1）。样本针抽吸的尿液自动与一定配比的专用稀释液和染色液混合，成为测试样本液。这种测试样本液被导入形成鞘流的的流动池中，一定量的测试样本液被配置成一列穿过流动池。激光从垂直方向照射通过流动池的测试样本液流，受光元件检测出一个个有形成分的散射光信号和荧光信号。散射光信号依据光的散射方向有两种不同的散射光成分，即前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）成分。分别由各自的光电二极管转换成电信号。荧光由光电倍增管转换成荧光信号（FL），这也是一种电信号。由专用的信号处理电路对这些电信号进行波形处理和分析，并将各种有形成分的脉冲波高值或脉宽值等特征参数存入CPU内保存。通过这些参数的组合自动制作二维散点图。最后，用装置独有的计算方法对散点图进行自动分析，对尿中有形成分进行划分和定量。

对象和方法
1. 对象
1）再现性和稀释直线性
       （1）确认细菌数检测性能要使用下列ATCC菌株：
       再现性：3 个菌种
            ·Escherichia coli(ATCC11775)
            ·Staphloccus aureus（ATCC C29213）
            ·Enterococcus faecalis (ATCC29212)
       直线性：2 个菌种
            ·E. coli(ATCC11775)
            ·S.aureus（ATCC C29213）
       (2) 对于白细胞数的线性，从泌尿科的患者尿中选脓尿用于评价。
2）相关性
       （1）用UF-1000i测得的细菌数与定量培养法的相关性评价中，使用了泌尿科的81 例患者样本。但是，因为对尿检阳性、而琼脂培养阴性的7 例检样怀疑有抗菌剂等发育阻碍的影响，在本次评价中被排除在外4）
       （2）用UF-1000i测得的白细胞数与显微镜法的相关性评价中，使用了泌尿科的128例受诊尿检样
2. 方法
1）使用ATCC菌株的UF-1000i和定量培养法的同时再现性比较
       预先用心脏浸剂液体培养基（日水制药社）进行ATCC 菌株的前培养（35℃，静置），制成浓厚菌液
（10∧7CFU/mL）。使用生理盐水（大冢制药社）将这种浓厚菌液稀释至规定浓度（10∧4～10∧5CFU/mL），调制成待测样本。对这种调制样本同时进行10 次检测，根据检测结果求出平均值和标准偏差，再计算出CV（%）。
       对照法采用的是定量白金耳法，该方法是常规检验用的定量培养法之一。预先用生理盐水将上述调制菌液稀释至能够进行菌落计数的浓度，使用1μL 的定量白金耳，涂布在10 片不同的CLED 琼脂培养基（日水制
药社）上后，进行了一昼夜（约18～24 小时、35℃）的静置培养。琼脂培养基的涂布时间要尽可能与用
UF-1000i进行检测的时间重合。涂布的第二天，用目视法对在CLED 琼脂培养基上观察到的菌落数进行计数。根据培养基上的菌落数和涂布量计算出细菌数，再根据合计10 片的计算结果求出平均值和标准偏差，再据之计算出CV（%）。
2）使用ATCC 菌株的细菌稀释线性和使用泌尿科患者尿液的白细胞稀释线性
       用心脏浸剂液体培养基进行E.coli 菌株和S.aureus菌株的前培养，制成浓厚菌液（10∧7～10∧8CFU/mL）。
       用生理盐水将这种浓厚菌液制作成10 倍稀释系列，分6 级调制了最高10 万倍稀释的稀释液。检测结果采用的是2 次检测的平均值。取离装置的直线性保证范围上限10∧7CFU/mL 最近的检测结果作为比较对照的细菌数理论值基准点，根据稀释倍率算出了理论值。
       关于白细胞数的直线性，从临床样本中选择脓尿（白细胞浓度约为2000/μL），使用生理盐水制作2 倍稀释比例，检测结果采用的是2 次检测的平均值。
3）使用尿样的对照法与UF-1000i的相关性
（1）细菌定量培养法
       定量培养用的琼脂培养基用的是能够阻止部分菌株游动的CLED 琼脂培养基。使用微型移液管（艾盆特路夫（音）社制）取生理盐水制作适宜稀释比例，使样本涂布后的菌落数小于约 100～1000 个。用前述稀释比例样本100μL，涂在琼脂培养基上。另外， 以UF-1000i的检测结果为参考，选择了2种适宜浓度的涂布样本。培养条件为35℃，空气良好的条件下18～24 小时。用镜检法对琼脂培养基上的菌落进行计数，根据得到的菌落数和稀释倍率计算出原尿中的细菌数。
（2）镜检法计算白细胞数（KOVA 直接法：非离心尿的计算盘法）
       作为白细胞数的对照方法，采用了在KOVA载玻片（拜尔梅地卡耳（音）公司）上进行确认的方法。如图2所示，KOVA载玻片上刻有容器和区划（栅格），全计算区划相当于0.9μL。用显微镜的低倍镜或高倍镜进行观察，可根据有形成分的计数及其区划数计算出每1μL尿中的个数5）。用KOVA载玻片计算得出的值被用作相关性试验数据。另外，显微镜观察采用无染色方式，采用相差显微镜（OLYMPUS 公司生产的BX-51）。

（3）用UF-1000i进行白细胞数和细菌的检测
       UF-1000i 具有红细胞、白细胞等有形成分检测用和尿中细菌检测用的两个系列专用试剂。由于这些专用试剂的采用，白细胞和尿中细菌的检测精度比原先的机型有提高。尿中细胞检测和尿中细菌检测用1 次抽吸的尿样来进行，样本使用2 个系列的专用试剂在装置内的各专用反应槽中自动稀释和混合。
       进行尿中细胞检测时，首先，吸样针将约1mL尿样吸入仪器内，在约35℃保温的反应槽内给150μL自动添加并混合435μL稀释液和15μL染色液，尿中有形成分的细胞内构成成分和细胞膜被荧光染色。采用流式细胞测量法对染色样本实施检测，一个个有形成分受到激光照射。从中获得的散射光信号和荧光信号被当作代表各种有形成分的参数用于分类和计数。
       进行尿中细菌检测时，用上述方法抽吸的尿样本中，有62.5μL 在另一个约42℃保温的反应槽内与425μL稀释液混合。接着，自动添加并混合12.5μL染色液。专用稀释液有促进细菌膜通透性的作用，接着，再添加并混合荧光色素，菌体内的核酸成分即被特异性染色（图3）。染色样本液被输送到检测部，在用流式细胞测量法检测散射光信号和荧光信号的同时，用专用计算法对细菌进行分类和计数。

结果
1. 再现性
       3种不同细菌（菌浓度10∧4～10∧5CFU/mL），定量培养法的CV值为27.8～50.8%，UF-1000i的CV值为7.6～11.2%（表1）。

2. 稀释直线性
       在10∧3～10∧7CFU/mL 范围内，使用E.Coli（ACTT 菌株）等的稀释直线性对于理论值取得了良好结果（表2，图4-1，4-2）。在大约3～2500/μL的范围内，白血球数的稀释直线性对于理论值取得了良好结果（图4-3，4-4）。

3. 相关性
       与细菌定量法对照，用2×2 表对UF-1000i 的细菌检测结果的一致率进行了评价。结果，当n=74，截止
值为10∧4CFU/mL 时，灵敏度96.4%（27/28），特异度89.1%（41/46），一致率91.9%（68/74），PPV84.4%（27/32），NPV97.6%（41/42）（表3）。图5-1为定量培养法与UF-1000i法的相关图。
       另外，对于白细胞数对照法（KOVA 直接法）的相关，n=128 时，y=1.01x+8.88,r=0.9592（图5-2）。

考察
       对再现性的研讨中，采用1μL 定量白金耳法为对照评价法，但同时还考虑了用UF-1000i 分析的试样量的
差异和评价时所用试样群的不同引起的再现性精度变化。所以，为了调查UF-1000i 不同分析容量模式之间
的差， 以1μL定量白金耳法为对照，分别对1μL分析模式与6μL 分析模式时的再现性进行了补充评价。使用S.aureus 菌株调制了浓度约为10∧4CFU/mL 菌液，把这样的菌液用作评价试样时，10 次同时再现性的结果为：对于对照法的CV，1μL分析模式时约为25%，6μL 分析模式时约为11%。另外，使用E.faecalis 菌株时的CV 分别为约63%、约32%和约8%。而且，关于使用含菌检样的10 次同时再现性，UF-1000i 的任何一种模式都比1μL定量白金耳法更加优良。
       从以上事情可以看出，定量白金耳法有几项误差因素。第一项是用定量白金耳采集试样时试样量的差别，第二项是琼脂培养基上涂布试样时由操作技巧带来的差别。这样，在认识到琼脂培养法包含有若干误差因素的基础上，对低浓度菌进行检测计数时有必要注意在操作技巧上尽可能排除误差因素。另一方面，因为
UF-1000i的检测系统从检样液的抽吸到到稀释、染色、检测，已经全自动化，所以能够排除人为的误差因素。另外，如果配置取样器（选购件），从试样的搅拌到抽吸的全部动作均可实现自动化。
       虽然本次研讨未对白血球再现性进行评价，对于出现约10/μL的低浓度白血球的试样，UF-1000i的同时再现性显示出良好结果（CV 约为15%），相对于KOVA载玻片直接法，UF-1000i 能够以良好精度进行检测一事得到了确认6）。
       从关于相关性的研讨结果来看，UF-1000i显示出能够以良好精度从10∧3CFU/mL 指令的低浓度菌中检测出细菌的能力。但是，用定量培养法判定为完全无细菌生长的阴性的10 例中，UF-1000i 发现了显示细菌存在的检样群（n=9），被认为是UF-1000i 和对照法双方乖离的原因。我们认为，其主要因素有以下两点：一是活菌和死菌的检测计数。在试剂的特性上，UF-1000i不分活菌和死菌对尿中含有的全部细菌进行计数。而作为对照法的琼脂培养法只有活菌才能在琼脂培养基上形成菌落，所以，菌落计数数（活菌数）与UF-1000i 测定的细菌数（活菌加上死菌）产生乖离。二是研讨中使用的细菌在琼脂培养基上为“静菌”，不发育，亦即可能正处于所谓的“不能培养状态”（VBNC 状态：viable but nonculturable）7）。遗憾的是，迄今为止的研讨还没有涉及到乖离检样群原因的特定。今后，对于乖离检样的确认，需要实施革蓝氏染色之类的另行证明细菌存在的手段。另外，关于细菌数的评估，作为评估对象的母集团是非常重要的，必须考虑治疗履历和使用药剂等临床信息并用于评估。
小结
       从原理性研讨的结果来看，UF-1000i显示出比目视镜检法和定量培养法优良的再现性，在菌浓度10∧3～10∧7CFU/mL范围内有着足够的细菌计数性能。另外，白血球计数方面，检测性能比目视镜检法高，实现了自动化。细菌计数方面，培养法本身的再现性精度等问题已经明确，整体性的尿中细菌数的计数能力方面获得了与培养法良好的相关性。
       UF-1000i 对白血球和细菌的迅速计数能力使得计数可以作为UTI诊断指标来使用。今后，以使用UF-1000i的EBM 为基础，可以期待感染症治疗药剂的用药支援和用药后的效果判断（患者监视上的应用）等诊断、治疗支援方面的应用。
参考文献
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3) Eisenstadt J , Washington JA. Diagnostic microbiology for bacteria and yeasts causing urinary tract
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6) Cornelia O, Andreas H. Quantitative Particle Analysis: Integrative Approach for the Optimal Combination of
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7) Anderson M, et al. Viable but Nonculturable Bacteria are Present in Mouse and Human Urine Specimens. J Clin Microbiol.2004;42(2):753-758.
                                                                                                                                希森美康供稿
                                                                                                                                编辑：范伟伟