尿蛋白质组学在泌尿系统疾病生物标记物鉴定中的应用

大山

                                                                            武警河北总队医院     马玉国，赵红丽，赵俊月，田红娟
1 正常尿液的蛋白质组学研究
       因为无创性优点，尿蛋白质组学研究成为人类蛋白质组学研究的重要领域。1996年，Marshall和Williams用“染料沉淀法”浓缩正常成人尿液，再以双向电泳进行分析，成功建立了正常人尿液蛋白的2-DE凝胶图谱，但是未进行进一步的分析鉴定。这是应用蛋白质组学技术分析正常人尿蛋白成分的第一步。1997年Heine等用高效液相色谱电喷雾串联质谱(HPLC-ESIMS)进行研究，鉴定出34个高丰度蛋白分子，包括白蛋白、载脂蛋白、胶原及前胶原等，并得到正常人尿液多肽及蛋白片段图谱。2002年，Thongboonkerd 等分别用“丙酮沉淀”和“超速离心”法分离正常成人尿液蛋白成分，并采用2-DE”基质辅助激光解析电离．飞行时间质谱”进行分析，凝胶显影67个点，鉴定出47种蛋白分子，其中。diphor21、生长相关蛋白43和 I-myc(一种致癌基因产物)等首次在尿蛋白中被发现。该结果说明，超速离心法分离出的蛋白质和膜蛋白，是常规丙酮萃取法所不能获得的，单一方法往往不能获得较为完整的尿蛋白质图谱。2003年，Wittke等联合应用毛细管电泳和电喷雾飞行质谱技术建立了正常人尿液的“多肽组成图谱”(polypeptide pattern)，该图谱显示了247个多肽点，而且每一个多肽点均可在50%以上的正常人尿液中检测出。尽管这两项研究采用的技术都具有高通量优点，但对于蛋白质的进一步鉴定和定量分析还存在很多困难，限制了它的临床应用。2004年，Schaub等应用表面加强激光解析电离-飞行时间质谱技术分析了健康人晨尿中尿蛋白的分子组成，发现女性初段尿与中段尿的蛋白分子组成不同，而男性却无此差异。这些研究结果显示代表先进技术的蛋白质组学的重要性，即：随着技术方法的进展，由尿液中检测并认识的蛋白分子越来越多，为进一步探讨这些蛋白分子在疾病状态下的变化和意义奠定了基础。2004至2005年，有人鉴定出了近800种蛋白质，极大地扩展了尿蛋白质组的知识范围，并为后续的尿蛋白质组学生物标记物的发现奠定了基础。2006年，Adachi 在健康成人的尿液中鉴定出超过1500种的蛋白质(或肽类)，更说明了人类尿蛋白质组的复杂性。在这项研究中鉴定的大部分蛋白质可以用膜蛋白来代表，这可能是尿中生物标记物的一个重要来源。最近，基于鼠模型试验数据，胎球蛋白A(Fetuin-A)已经被提出作为急性肾损伤的生物标记物。
2 尿蛋白质组学技术在肾脏病研究中的应用
       2．1 肾小球疾病  肾小球肾炎是肾衰竭的一个主要原因，诊断肾小球疾病需要联合肾功能的评估、尿蛋白的定量和尿液镜检分析等。这些检测结果可有效的评估肾损伤，但是它们不能很好地评估肾的进行性、活动性炎症。2002年，Lafitte等通过2-DE 对糖尿病肾病、微小病变型肾病及原发性近端肾小管性酸中毒患者的尿液进行分析，结果发现，与正常人相比，这些患者的尿液蛋白组成存在不同，但并未鉴定出疾病相关特异性标志物。2004年，Mischak等认为，用毛细管电泳联合质谱技术对糖尿病肾病早期患者尿液多肽变化规律进行研究，可以快速准确地对尿液中不同类型多肽进行鉴定并加以区别，监测糖尿病早期肾损害。同年，Thongboonkerd等用丙酮萃取尿蛋白技术，采用2-DE 基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱方法分析了糖尿病肾病、局灶节段性肾小球硬化(Pscs)及V型狼疮性肾炎患者的尿蛋白，发现这些疾病的尿蛋白质图谱与正常人相比存在明显差异，共鉴定出25个差异表达的蛋白分子。所有患者尿中白蛋白、转铁蛋白及a1抗胰蛋白酶水平显著增加，而激肽原(kininogen)和佛波醇23(phorbolin23)的含量明显降低。肾脏激肽原和激肽释放酶(kallikrein)的缺乏与系统性高血压有关。该研究中所有的患者均有。肾病综合征及高血压，因此尿液中激肽原的减少可能提示这些患者有肾脏激肽原的耗减。该研究同时发现，一种尚未鉴定的蛋白分子(spot No1230)和一种类似猪生长激素(GH)的蛋白分子仅在FSGS患者的尿中显著增加。GH在糖尿病肾病的发生中可能起着一定的作用，但是在FSGS发生发展中的作用迄今尚未见报道。最近，有研究表明垂体功能减退患者长期应用GH替代治疗后可能出现FSGS，提示GH在FSGS的发生发展中可能起着一定的作用。此外，2007年，Hassan等的研究结果显示，在糖尿病肾病患者尿液中高浓度的泛素核蛋白体融合蛋白(UbA52)可作为一种诊断标记物。
       2006年，Park等的研究结果表明，IgA肾病患者尿液有216个蛋白位点表达异常，其中82个位点高表达，134个位点低表达。在这216个位点中，有84个蛋白位点与IgA肾病有特定的联系。
       现在已经开始研究一些候选的生物标记物，包括细胞因子、化学增活素和生长因子，并且已经开始应用质谱分析法，在动物模型和有各种水平的活动性疾病中，筛选鉴定肾小球肾炎的尿生物标记物。尿生物标记物已经用于区别活动性和非活动性狼疮肾炎。这些都提示，尿生物标记物将来可能用于监测肾小球肾炎的I临床治疗效果。这种可能性可在糖尿病肾病的独立研究结果中找到根据，微量蛋白尿是早期糖尿病肾病的一种重要标记物，但此时肾小球已经发生了明显的损伤。已经有人使用质谱分析法从糖尿病患者的尿液中鉴定出特殊的尿多肽，提示这些指标在将来可用于对某些具有潜在肾损伤患者的早期确诊。
       2．2 肾移植和急性肾移植排斥反应  在外科手术局部缺血-再灌注损伤和急性移植排斥反应中，肾小管损伤是主要的特征，早期检测急性肾小管损伤是必需的。临床上将肾管型蛋白视为局部缺血一再灌注损伤和延迟移植物功能的生物标记物。已经有人使用质谱分析法筛选出急性移植物排斥反应中的早期生物标记物，但如果这些蛋白不具有高丰度，仍然很难鉴定。使用这些尿生物标记物非侵入性的监测。肾移植效果仍然有一段路要走。
       急性肾移植排斥反应的早期诊断对肾移植患者具有重要临床意义。以往常用肾活检作为主要检查手段，而寻找非损伤性检查手段一直是。肾脏移植领域研究的课题之一。早在1989年Lapin等就试图通过尿2-DE寻找急性肾移植排斥反应的生物标志物，但直至2003年Hampel 等才通过2DE-ESIMS和MALDI-TOFMS鉴定出与急性肾移植排斥反应相关的候选标志物，如β2微球蛋白、视黄醇结合蛋白和碳酸酐酶在急性肾移植排斥反应患者明显增高。2005年，Schaub等应用SELDI-TOF-MS和LC-MALDI-MSPMS技术对肾移植急性肾小管损害的患者中段尿液进行分析鉴定，认为尿中β2微球蛋白可作为诊断肾移植急性肾小管损害的标志物。
       2．3 急性肾损伤(AKI)   急性肾损伤是一种高发病率和高死亡率的临床常见疾病，寻找急性肾损伤的生物标记物是当代研究的热点。传统的尿生物标记物，比如管形和排泄率，对于早期诊断急性肾损伤缺乏敏感性和特异性，其他的传统的尿生物标记物，例如滤过高分子量蛋白、管形蛋白或酶，也都缺乏特异性和标准的测定方法。幸运地是，功能性基因组学和蛋白质组学等新技术的应用，发现了一些新的生物标记物，一些可靠的分子已经在动物模型和受试者中用以鉴别和检测肾损伤。一些物质如自细胞介素-18、肾损伤分子-1和NGAL被认为是很有用的指标，而且相关临床试验已经开始，但是还没有过渡到临床应用阶段。外来胎球蛋白-A近期在动物模型和重病特别护理中已经被鉴定为急性肾损伤的潜在的尿生物标记物。
3 尿蛋白质组学技术在其他泌尿系统疾病研究中的应用
       许多肾肿瘤相关分子可以被分泌到尿中，因此，理论上认为尿生物标记物可作为膀胱癌、肾细胞癌和前列腺癌的早期诊断和监测指标就不足为奇了，在蛋白质组学的研究领域中，癌症领域的研究成果最多。
       1996年，Rasmussen等用2-DE在膀胱鳞状细胞癌患者尿液中鉴定出124个高丰度蛋白分子。在这些蛋白分子中，牛皮癣素仅存在于膀胱鳞状细胞癌患者的尿液中，是人类角质化细胞中主要的蛋白质，可作为SCC潜在的生物标记物，免疫蛋白印迹证实了这一结果。2004年，Kageyama等应用窄pH值2-DE分析发现，钙网织蛋白在膀胱癌组织中高表达，并经Western blot证实。尿液Western blot发现CRT在膀胱癌中的敏感性为73%(95%可信区间62%~83%)，特异性为86%。但还需进一步的研究证实其在膀胱癌中的诊断价值。2005年，Saito等对40例膀胱癌患者和32名健康受试者的研究结果表明，金属蛋白酶基质-2(MMP-2)、-9(MMP-9)、纤维素结合蛋白(FN)及它们的碎片在膀胱癌患者尿液中存在，而在健康者中不存在。
       Sarto等发现肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)患者的肾脏组织表达Mn-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的两种多聚体和5种单聚体，正常人的肾脏组织中只表达Mn-SOD的两种单聚体形式，而不存在多聚体形式，这主要是因为不同的转录后修饰造成的。除此之外，迄今为止，还没有发现可能评估RCC诊断和治疗情况的生物标记物。
       1982年，Edwards等就鉴别出一种可作为前列腺癌候选标记物的标记物。称之为前列腺癌抗原(PCA-1)，但没有做关于此蛋白的进一步研究。经过多年研究，这个抗原目前已经广泛应用于临床。2004年，Rehman I 等应用2D-PAGE和MALDI-TOF MS方法研究显示，钙颗粒素B/MRP-14可作为前列腺癌一种可能的牛物标记物。
       目前研究表明，有很多分子都可能成为尿的生物标记物。但这些研究大多数都是基于一小部分患者，因此所报道的尿生物标记物的敏感性和特异性都不高，目前很难估计他们潜在的临床应用价值。
4 问题与展望
       蛋白质组学方法的建立为在蛋白质水平研究生命活动和人类疾病提供了新的有效手段，但在技术上仍存在不足。比如，应用2-DE技术进行蛋白质分离，这种技术耗时长且很难同其他蛋白质组技术相结合，并且这种技术的分辨能力有限，尤其是对于小的蛋白质和肽类物质。这些局限使它的使用受限，促使人们选用基于质谱分析的相关技术。
       蛋白质样品的准备直接影响到电泳及检测效果。现已有多项增加蛋白质溶解性方法的报道，提高了电泳的可重复性。并且目前国际上已开始重视研究以色谱/电泳-质谱为主的技术平台。通过质谱分析法，正常人类蛋白质组学已经能至少鉴别1000种不同的蛋白基因产物和大蛋白质的许多肽片段。目前基于质谱分析技术所测定的数据而衍生出的尿中外来蛋白数据库已经建立，但对不同疾病状态下尿液分析还缺乏可信的标准图谱。有关尿液蛋白质的数据库及生物信息学也有待进一步完善。
                                                                                                                                    编辑：范伟伟