尿调蛋白酶联免疫吸附试验检测方法的建立及应用

河东狮

                                                            刘颖1，陈育青1，周晶晶1，韩佳1，梁彧1，李雪迎2，张宏1
1．北京大学第一医院肾内科，北京大学肾脏疾病研究所，卫生部肾脏疾病重点实验室；2．北京大学第一医院医学统计室
       [ 摘要] 目的： 建立尿尿调蛋白的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA）检测方法，并对IgA 肾病患者的尿尿调蛋白水平监测进行进一步验证。方法：以多克隆抗体作为包被抗体，单克隆抗体作为检测抗体，建立尿调蛋白的快速双抗夹心检测方法，检测精确性及重复性，并与商品化的试剂盒进行比较，检测166 例IgA 肾病患者和正常人的尿尿调蛋白水平。结果：获得的标准曲线为0.78~12.5 g/L，实验室内变异系数为7.5%，实验室间变异系数为7.9%。商品化试剂盒与本实验方法结果比对，相关系数为r=0.615，P<0.001；166 例IgA 肾病患者的尿尿调蛋白/尿肌酐比值低于正常人。结论：尿尿调蛋白的ELISA 检测方法灵敏，重复性较好，可运用于大样本的人群检测，IgA 肾病患者的尿尿调蛋白分泌低于正常人。
       [关键词] 尿调蛋白；酶联免疫吸附试验；肾小球肾炎，IGA

       尿调蛋白（uromodulin）又称为Tamm-Horsfall 蛋白，最早于1950 年由Tamm和Horsfall 于尿中发现[1]，是尿液中含量最丰富的蛋白质，由肾小管髓袢升支粗段的上皮细胞粗面内质网合成，经过高尔基体的加工，分泌到肾小管上皮细胞管腔面的细胞膜上，部分进入尿液，成为构成管型的重要成分[2]。既往的研究证实尿调蛋白与肾结石和泌尿系感染有关，近几年研究提示尿调蛋白在慢性肾病中可能发挥重要的作用。有研究发现，尿尿调蛋白的水平与人群中慢性肾病的发生密切相关[3-7]，可能有助于IgA 肾病的诊断[8]，因此，建立实用、可靠的检测尿尿调蛋白的方法非常迫切。文献报道的检测方法操作繁琐、所需时间长、有放射性污染[9-11]，对于大样本人群检测受到限制。本研究建立了针对尿调蛋白的简便、快速的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA）测定方法，同时对IgA 肾病患者进行了尿尿调蛋白的检测，探讨IgA肾病中尿尿调蛋白含量的变化。
1 资料与方法
1.1 材料
       正常人尿样：取肾功能正常、尿常规检查阴性的正常人所留取的尿液标本，共48 例，男27 例，女21 例，平均年龄（32.8±1.3）岁，估计肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）为(102.3±3.69) mL/min/1.73 m2，留清晨第1 次尿液，离心后-80 ℃保存。
       IgA 肾病患者：选择北京大学第一医院肾内科经肾穿刺确诊为IgA 肾病的住院患者166 例，除外合并妊娠、泌尿系感染、糖尿病、肿瘤、肝硬化、过敏性紫癜、痛风和肾结石的患者。患者的年龄(31.5±0.9)岁，男84 例，女82 例，eGFR 为(101.83±1.04) mL/min/1.73 m2。于肾穿刺当日留取清晨第1 次尿液，离心后-80 ℃保存。
       所有参与本研究的患者和志愿者均签署了知情同意书。
1.2 试剂
      本研究应用的主要试剂有兔抗人尿调蛋白多克隆抗体（Biomedical Technoloqies Inc BT-590），小鼠抗人尿调蛋白单克隆抗体（CEDARLANE CL1032AP），辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥公司ZB-2305），牛血清白蛋白（华美转导生物有限公司BP005），尿调蛋白校准品（Mybiosource MBS36409），尿调蛋白检测试剂盒（加拿大Mdbioproducts 产品，货号M036020）。
1.3 免疫组织化学染色
       取肾肿瘤切除手术时留取的正常肾组织，经石蜡固定后切片，厚4 um，进行常规免疫组织化学染色，分别以兔抗人尿调蛋白多克隆抗体和小鼠抗人尿调蛋白单克隆抗体作为一抗。
1.4 ELISA 方法的建立
       多抗包被：用0.1 mol/mL pH 9.6 的碳酸盐缓冲液稀释兔抗人尿调蛋白多克隆抗体，酶标板100 uL/孔，37 ℃孵育1 h，0.1%（体积分数）Tween-0.01 mol/L pH7.4 的PBS 液(即PBST)洗3 次，置于-80 ℃备用。
       封闭：3%牛血清白蛋白（BSA，0.05 mol/L PBS稀释）室温封闭1 h，PBST洗3次。
       加样：Uromodulin标准品从12.5ng/ml开始对比稀释，尿液标本以TEA（0.5%Triton X-100 和20mmol/L EDTA, pH 7.5,）1:200─4000稀释，100ul/孔,37℃孵育2小时，PBST洗3次；
       检测抗体：小鼠抗人尿调蛋白单克隆抗体用PBST稀释，100ul/孔37℃孵育1小时，PBST洗3次；
       酶标抗体：辣根酶标记山羊抗小鼠IgG 1: 5000稀释，100ul/孔37℃孵育0.5小时，PBST洗3次；
       显色：TMB显色，酶联检测仪上读数。
       数据处理：以uromodulin校准品浓度绘制标准曲线，当r值在0.99以上方可使用。
       批内精密度：相同标本同时检测20次，其值的变化算出实验内的变异系数。
       批间精密度：不同日期、相同标本测出的uromodulin数值之间的变异系数。
1.5 尿肌酐检测方法
       相关标本尿肌酐检测采用碱性苦味酸法，用日本东芝Hisachi 7170 全自动生化分析仪进行检测，此项由北京大学第一医院检验科协助完成。
1.6 统计学分析
       所有数据均经正态分布检验，描述性数据用均数±标准误表示。尿调蛋白商品化试剂盒检测结果与本方法检测比较采用配对t 检验相关分析，尿尿调蛋白和IgA肾病的相关性采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 抗体结合特异
       使用尿调蛋白单克隆抗体和多克隆抗体进行肾组织的免疫组化染色，可看到尿调蛋白特异地表达在部分肾小管上皮细胞，尿调蛋白特异地分布在肾小管髓袢及远曲小管（图1）。

2.2 标准曲线
       经方阵滴定，得到的最适条件为：多克隆抗体1:4 000以0.1 mol/mL pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释、包板；单克隆抗体1:500以PBST稀释；校准品及尿液标本以TEA（即0.5% Triton X-100和20 mmol/L EDTA, pH 7.5）稀释，校准品曲线范围为0.78~12.5 g/L（图2）。

2.3 精确性与重复性
       20份样本的批内精密度为7.5%，5份样本（其值分别为3.5、11.8、23.6、33.4、39.3 mg/L）测定3次的批间精密度为7.9%。
2.4 商品化试剂盒与本实验方法结果比对
       55例不同浓度的标本商品化试剂盒和本研究所建立的试验方法同时检测，相关性分析发现相关系数为r=0.615，P<0.001（图3）。

2.5 IgA肾病患者尿尿调蛋白/尿肌酐的相关性（图4）
       采用尿尿调蛋白/尿肌酐代表尿调蛋白的肾脏排泄。ANOVA分析发现，IgA肾病患者的尿尿调蛋白/尿肌酐比值为(3.52±0.59) mg/g (n=166)，明显低于正常人[(18.39±3.46) mg/g, n=48, P<0.001]。

3 讨论
       建立本实验方法的关键是要有与uromodulin特异性结合的抗体。在正常肾组织上进行免疫组织化学试验显示，阳性部位均表达于肾小管上皮细胞腔膜面，可以证实两种抗体均为高特异性抗uromodulin抗体，符合实验要求。
       经过多次对试验结果验证，实验的最适条件为：多克隆抗体以1:4 000包板，单克隆抗体以1:500作为检测抗体，标准曲线相关性可以达到0.99以上，最低检出限为0.1 mg/L，完全可以满足科研工作的要求。20份标本的室内变异系数为7.5%，表明实验的准确性是令人满意的。尽管ELISA的影响因素很多，但是相同样本在不同日期的3次检测结果变异系数为7.9%，小于15%，说明本方法稳定，检测结果重复性好。
       与商品化试剂盒相比，相同标本在不同检测体系所得结果具有高度相关性，证实本实验所建立的方法可以应用于尿液中uromodulin的检测。在检测结果可靠的前提下，低廉的检测成本与高昂的商品化试剂盒相比更有利于大量检测工作的开展。以往针对uromodulin的检测均为放射免疫的方法，该方法所得检测结果与本研究检测结果没有本质上的区别，但是放射免疫方法毕竟具有安全方面的隐患，对实验室及操作人员有较高的要求，不便于临床中大量检测工作的开展。
       总之，本方法快捷、稳定、可靠，灵敏度和精确度较高，对仪器设备要求低，无放射性污染，操作简便，适用于大量的尿标本检测。
       我们利用本研究所建立的方法对IgA肾病患者的尿尿调蛋白进行了检测。尿调蛋白是特异性表达在肾小管上皮细胞的蛋白质[2]，国内关于IgA肾病的尿液蛋白质组学研究发现，IgA肾病患者中有特异的蛋白片段，经过鉴定为尿调蛋白，提示尿调蛋白在慢性肾病中可能有重要意义[8]。近期，国际相关研究报道尿调蛋白与慢性肾病存在联系[12-13]。本研究随机选取了166例IgA肾病患者检测尿尿调蛋白，并以正常人作为对照，发现IgA肾病患者的尿尿调蛋白/肌酐比值较正常人明显下降。
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                                                                                                                                    编辑：范伟伟