正常人尿蛋白质组学研究

想望

                                                                                                北京世纪坛医院      雷婷，赵旭宏，张曼
       【摘要】目的  初步建立正常人尿液蛋白质双向电泳图谱，分析正常尿蛋白基本组成，为疾病下尿液蛋白差异研究作参考。方法  用丙酮沉淀法对4例正常人尿液中蛋白质进行浓缩，用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离蛋白样品。凝胶考马斯亮蓝染色，GS-800 Calibrated Densitometer凝胶成像系统获取图像，PDQuest2D分析软件对图像进行背景消减、斑点检测、匹配、斑点位置重复性的系统分析，寻找表达蛋白。应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MAUDI—TOF)得到相应的肽指纹图谱，搜索相关数据库对蛋白质点进行鉴定。结果  对染色明显且独立的30个蛋白斑点进行鉴定，并对结果进行数据库检索，共有28个点获得有效匹配，包括各种血清白蛋白、免疫分子以及补体分子、载脂与转运蛋白、肽酶S1家族、细胞结构蛋白、蛋白酶抑制因子等，鉴定出的蛋白质大部分PI 在4~7之间。结论应用蛋白质组学方法分析正常人尿液蛋白质组成成分可行，初步建立了正常人尿液28个蛋白质图谱，为分析疾病状态下尿液蛋白质成分的改变提供了基础资料。
       【关键词】双向凝胶电泳；尿液；蛋白质组；肽指纹图谱

       尿液是血液经肾小球滤过、肾小管和集合管重吸收、排泄及分泌产生的终末代谢产物，其组成、数量与性状的变化携带有泌尿系统疾病发生、发展及预后的各种信息，也可反映机体整体代谢状态，与血清等其他体液样本相比，其获取无创、收集便利，并且蛋白组成相对简单、易于分析。蛋白质组学则是诠释蛋白所携带信息的最有效方法，为建立适合常规检验人群尿样处理的尿液蛋白质双向电泳图谱，选择重复性好、独立清晰的蛋白质位点进行质谱鉴定，多点全方位同时分析正常尿蛋白基本组成，为疾病的比较做正常参照体系，我们挑选了一定蛋白含量、一定清晰度、适合目前检验方法最小检测限之上的30个点进行分析，为分析泌尿系统疾病的尿液差异性改变提供对比资料。
1 材料与方法
1．1 材料
       1．1．1 标本来源  收集我院2009年3月体检中心4例正常人的清洁中段尿，男女各2例，平均年龄为35.5岁，均为体检健康的志愿者。
       1．1．2 实验试剂  二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IXa)和考马斯亮蓝购自于美国Sigma公司；固相PH梯度干胶条(IPG，Strip3—10，17 cm)、两性电解质(Pharmalyte，PH3—10)、覆盖液、低分子量标准蛋白质、尿素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、SDS、Tris—HCL和CHAPS购自于美国BIO-BAD公司；其余试剂均为国产分析纯。
       日立7080-ISE生化分析仪购自日本；PROTEAN IEF Cell等电聚焦仪购自于BIORAD公司；PROTEAN Ⅱ xi 2-D Cell 垂直电泳槽，GS-800 Calibrated Densitometer凝胶成像系统获取图像，用PDQuest2D分析软件对图像进行凝胶图像分析。
1．2 方法
       1．2．1样品处理  收集晨起清洁中段尿100 mL，2 h内4℃1500 r/min离心15 min，收集上清液，弃去细胞碎片和核，上清液在血细胞计数板观察无细胞或颗粒，取上清液与-20℃预冷纯丙酮1：1混匀，4℃静置15 min，12 000 r/min离心5 min，弃上清，将沉淀溶于样品裂解液(9 mol/L Urea、4%CHAPS、65 mmol/L DTT、0.5%两性电解质)中，超声10 Hz、10 s 冷却50 s 重复6次，4℃12 000 r/min离心10 min，取上清，过除盐柱除盐，蛋白质千粉溶于裂解液中，日立7080-ISE生化分析仪检测总蛋白浓度。分装，-80℃冻存备用。
       1．2．2 双向凝胶电泳(1)固相等电聚焦：参照BIO-RAD公司操作指南进行，电泳上样总体积约450 uL(约1500 ug总蛋白)，一向条件为：50 V低压水化16 h，然后进行等电聚焦，总电压时间为60 000 Vh。(2)平衡：等电聚焦后，迅速取出IPG胶条分别于第一步和第二步平衡液中振摇15 min，用滤纸条吸取多余的平衡液。(3)SDS-PAGE垂直电泳：将平衡后的IPG胶条移至12%的凝胶上端，起始电压为100 V，待样品进入SDS胶浓缩成一条线，0.5 h后加大电压到200 V。直至溴酚蓝到达凝胶底边处停止电泳。
       1．2．3 考马斯亮蓝染色凝胶固定液(40%乙醇，10%乙酸)固定30 min后，双蒸水冲洗5 min 3次，考马斯亮蓝G250染液(0.12%考马斯亮蓝G250，10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇)染色过夜，脱色液(40%甲醇，10%乙酸，双蒸水至100%)进行褪色直至背景清晰。
       1．2．4 图像分析利用GS-800 Calibrated Densitometer 凝胶成像系统获取图像，PDQuest2D分析软件对图像进行背景消减、斑点检测、匹配以及斑点位置重复性的系统分析，寻找其固定表达蛋白。
       1．2．5 MALDI-TOF-MS肽指纹分析筛选出正常尿液蛋白图谱上蛋白重复性好、表达清晰、界限较明显的蛋白斑点，送中国科学院生物物理研究所基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)进行肽指纹图谱鉴定。
       1．2．6 蛋白质序列数据库检索将质谱结果放人互联网上用MASCOT软件在相关数据库进行肽指纹图谱检索分析，网址为：http：//www.matrixscience.cow./，其参数设定如下：Database：MSDB；Enzyme：trypsin；Peptide nilus accuracy：200．00 ppm；Maximum number of missed cleavage：1；Modifications：fLXed carbamidomethyl(C)variab：Acetyl(N-term)。
2 结果
       2．1 双向凝胶电泳采用固相化pH梯度等电聚焦为第一向和SDS均一胶(T=12%)的垂直电泳为第二向，按照上述各实验步骤，提取正常人尿蛋白，尿蛋白用17 cm，pH 3~10的IPG胶条进行二维电泳，获得了清晰度高、重复性良好的考染双向凝胶电泳图。正常人的尿蛋白电泳图谱见图1。
       2．2 质谱分析从左到右pH值为3~10，从上到下分子量递减。选取图中表达点分子量约18~94 kD，pH值在3~10范围内重复性好、染色清晰、界限明显的30个蛋白位点进行质谱分析，位点位置见图2。

       2．3 正常30个尿液蛋白匹配结果将每个切取蛋白点做质谱，质谱结果进行生物信息学分析，每个点取最高分值对应的蛋白质作为匹配结果，共有28个点获得有效匹配，其中编号18与20的两个点未得到有效匹配。见表1。

3 讨论
       自从提出“尿蛋白组学”(urinary proteomics)概念以来，利用蛋白质组学技术对尿液蛋白质进行高通量、系统性地分析和鉴定得到快速发展，并用于解释生理学代谢、毒理及许多疾病的进程，尤其泌尿系统疾病中蛋白质的改变可直接经尿道分泌到尿液中，因此研究尿液中蛋白质改变可以帮助理解疾病发病机制、寻找早期诊断的生物学标记。尽管尿液的成分非常复杂，但由于尿液易获取无创伤，国内外学者目前热衷于对生理和疾病状态下的尿液进行蛋白质组学分析，获得了正常尿液标准蛋白图谱、并研究疾病状态下尿蛋白的变化。
       本实验室在蛋白质组学方面有着独特优势，靳胜等利用2D-PAGE结合MALDI-TOF技术研究分析膀胱癌组织与正常组织之间的固定差异表达蛋白质，赵旭宏等对前列腺增生的尿液蛋白质学进行了研究，建立了成熟而稳定的技术平台，在此平台的基础上本实验选择了正常人的尿液为研究对象，初步建立正常人尿蛋白图谱，多点全方位同时分析正常尿蛋白基本组成，为疾病的比较做正常参照体系，利于与不同疾病状态下的尿蛋白图谱进行鉴定、分析。
       本实验中我们对正常人尿液中的蛋白质进行分离、提纯，通过双向凝胶电泳技术获得重复性好的正常尿蛋白电泳图谱，利用肽指纹图谱对染色明显且独立的30个蛋白斑点进行鉴定，并对结果进行数据库检索，每个点取最高分值对应的蛋白质作为匹配结果，共有28个点获得有效匹配。对其进一步进行生物信息学分析，获取的蛋白质包括：各种血清白蛋白(AMBP蛋白；白蛋白23 kDa片段；血清白蛋白亚型1；白蛋白；假定白蛋白；未命名白蛋白)；免疫分子以及补体系统(IGKC蛋白；人补体片段4b)；各种载脂与转运蛋白(甲状腺素结合蛋白；载脂蛋白AI；血清转铁蛋白)；肽酶S1家族(甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶2亚型)；细胞结构蛋白(肌动蛋白A2)；蛋白酶抑制因子(SERPINAl PR02275；ITIH4)；两种未知蛋白(eDNA FU51445，eDNA FLJ50830，均为高度类似AMBP蛋白)等。与THONGB00NKERD等分离鉴定出的47种蛋白中包括膜蛋白、转运蛋白、受体、黏附分子、信号转导蛋白、酶及细胞骨架蛋白等基本相符。进一步分析各蛋白的功能，例如：AMBP蛋白前体是存在于血清中的一种复合糖蛋白，降解为两种不同功能的蛋白质包括a1微球蛋白和bikunin。a1微球蛋白属于载脂转运蛋白超家族成员，在炎症过程中起调节作用。Bikunin是一种尿胰蛋白酶抑制剂，是Kunitz-type蛋白酶抑制因子超家族的一员，在许多病理生理过程中起着重要作用。ITIH4属于ITIH家族，由1个轻链和5个同源重链组成，通过与透明质烷共价作用使细胞外基质处于稳态，HAMM等研究表明ITIH家族基因在乳腺癌、结肠癌以及肺癌中明显下调，推测可能为抑癌基因家族，其中ITIH4基冈在结肠癌、胃癌、肺癌、肾癌以及前列腺癌等实体肿瘤中下调明显等。通过我们所获得的正常尿液标准蛋白图谱为参考，寻找不同疾病尿蛋白图谱中的差异蛋白，有希望获得新的标记物。
       整体分析我们所获得的蛋白，发现血清白蛋白仍占主导，因为尿液是一个高度复杂的蛋白质混合物，这些蛋白质来自血液在肾小球中的过滤产物、肾的分泌物及泌尿生殖器管道的分泌物，作为一种特殊的血液过滤物，尿液中的蛋白质组成类似于血液，在血清中占据主导地位的蛋白质一白蛋白也成了尿液蛋白质中最主要的成分，因此，要获得更多有意义的尿液蛋白就要有效的去除高峰度蛋白。以获取低峰度、含量少的蛋白质，关于这一点我们的实验条件还有待于优化。
       综上所述，通过实验条件的优化，应用蛋白质组学方法分析正常人尿液蛋白质组成成分是可行的，初步建立了正常人尿液蛋白质图谱，为分析疾病状态下尿液蛋白质成分的改变提供了资料。
       [志谢：感谢北京市优秀人才培养D类专项基金及国家高技术研究发展计划(生物医学关键试剂)课题组对本研究的支持；感谢北京世纪坛医院检验科和中国科学院生物物理研究所老师给予的支持与帮助。
                                                                                                                                    编辑：范伟伟