非浓缩尿蛋白电泳的临床应用

河东狮

                                                上海第二医科大学附属新华医院检验科     沈霞　张敏华　汪萍　陶美华
       【摘要】目的　尿液中各种蛋白质进行分离,用于区分尿蛋白类型。方法　应用十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶进行非浓缩尿蛋白电泳,对86 例肾脏疾病患者尿液样本(其中16 例经病理活检确诊)进行分析。结果　根据尿蛋白电泳剖象可以区分为肾小球性、肾小管性、混合性、溢出性及生理性蛋白尿。16 例经肾活检患者尿标本,其中肾小球性蛋白尿12 例,混合性蛋白尿3 例,1 例生理性蛋白尿。结论　本法具检测敏感性好,诊断符合率高,方法简便,省时,经扫描后可获半定量结果,胶片易于保存等优点。
       【关键词】尿蛋白; 电泳,琼脂凝胶; 肾疾病

       近年来,早期肾损伤的诊断已被大家所关注,蛋白尿是肾脏疾病的重要表现之一。实验室大多采用聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE) 技术来鉴别蛋白尿的来源,此法要求预浓缩尿液,往往需要4～5 d 才能报告结果,不符合临床需求。我们应用十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶电泳(SDS-AGE) 技术来进行蛋白尿的分类,用以评价肾脏损伤程度。该法尿液不需预浓缩,操作简便,省时(3 h) ,尿蛋白按其分子量大小予以分离,结果清晰,便于保存。
       临床上引起蛋白尿的原因,除肾脏疾患外,如糖尿病、药物及化学毒性、感染等导致的肾小管间质病变亦可呈现蛋白尿升高,为此,微量尿蛋白的检测已被大家所关注。我们应用SDS-AGE 技术进行非浓缩尿蛋白电泳,用于早期肾损伤的诊断和评价肾脏损伤部位。
材料和方法
一、对象
       1. 病例组:新华医院住院患者,经肾活检确诊病例16 例尿液样本,男8 例,女8 例,年龄3～54岁,平均28 岁, 取新鲜晨尿。尿蛋白含量60 ～10 200 mg/ 24 h ,其中局灶节段性肾小球硬化5 例,轻微病变性肾小球疾病4 例,系膜增生性肾炎2 例,IgA 肾病1 例,狼疮性肾小球肾炎1 例,弥漫性系膜增生性肾小球肾炎伴间质灶性纤维增生1 例,局灶节段性肾小球透明变性伴肾间质纤维灶性增生1例,节段系膜细胞轻度增生伴肾小管灶性萎缩1 例,另有新华医院肾脏门诊和住院患者新鲜尿液70 份。
       2. 对照组:健康人4 名,无肾脏病史及其他慢性病史。尿蛋白含量0～100 mg/ 24 h ,平均30 mg/24 h。
二、仪器与试剂
       1. 仪器:HYDRASYS 全自动电泳仪(sebia) 。
       2. 试剂:Hydragel proteinurie Kit (sebia) 内含: (1)pH 7. 0 ±0. 1 琼脂糖凝胶; (2) pH 6. 9 ±0. 1 SDS 缓冲条带; (3) SDS-溴酚蓝稀释液; (4) 0. 2 g/ dl 结晶紫染色液。
       3. 自备试剂: (1) 0. 9 g/ dl NaCl ; (2) 0. 1 %冰醋酸; (3) 15 %甘油。
三、方法
       1. SDS-AGE: (1) 样品采集及处理: 收集晨尿10 ml ,1 500 rpm ,离心5 min ,用磺柳酸作蛋白定性,结果大于+ + 的尿液样本,用0. 9 g/ dl NaCl 予以稀释。(2) 操作:取20μl SDS-溴酚蓝稀释液加入80μl已处理尿液,混匀,吸取5 μl 加入凝胶孔中(5 孔/板) ,扩散10 min。打开电泳仪装上缓冲条带,置凝胶于电泳板上启动,电泳15 min。取出凝胶置染色缸烘干、染色、脱色、固定,全过程耗时2. 5 h。扫描,报告结果。
       2. SDS-PAGE: (1) 样品采集及处理: 收集晨尿100 ml ,过滤。用磺柳酸作蛋白定性,根据蛋白定性结果,取适量尿液装入透析袋,浓缩,透析。为SDS-PAGE 备用; (2) 操作: 参照《临床肾脏病学》[2 ] SDS-PAGE 检测方法。
结果
       1. 尿蛋白经SDS-AGE 电泳后分类:见图1。从图中可以看出用SDS-AGE 电泳技术进行非浓缩尿蛋白电泳,可以分为非选择性肾小球性、肾小管性、混合性及生理性蛋白尿。

       2. 16 例经肾活检患者尿标本,其中肾小球性蛋白尿12 例,混合性蛋白尿3 例,1 例生理性蛋白尿可能,结果见表1。

       3. 新华医院肾脏科门诊及住院病人70 份尿样本检测结果见表2。

讨论
       在生理条件下,中分子以上蛋白质绝大部分不能通过滤过膜,滤过的分子量< 70 000 的血浆蛋白又大部分被肾小管重吸收或分解,为此,正常尿液内蛋白含量甚微。当肾小球通透性增加,肾小管重吸收能力减少,肾或其他组织分泌增加时,即产生蛋白尿。以往采用SDS-PAGE 技术,当SDS 与尿蛋白结合后形成一个带负电荷的分子团,由于各组份分子大小不同,经聚丙烯酰胺凝胶的分子筛作用,又利用电泳距离与分子量对数之间的反比关系可将不同分子量尿蛋白分离,并判断其分子量[1 ,2 ] 。SDS-PAGE具有较高的分辨率,但SDS2PAGE 操作繁琐,需要预浓缩尿液,有关文献报道,预浓缩超过25 倍可导致染色背景过深,且可能伴有低分子蛋白质的丢失,同一样品在柱胶上电泳结果也可能不同[3 ] 。因此,此法具有其一定的局限性。
       我们采用SDS -AGE 进行非浓缩尿蛋白电泳,利用琼脂糖凝胶的选择性成分及多孔性,亦根据蛋白质的分子量,将蛋白尿分为肾小球性,肾小管性,混合性,生理性及溢出性蛋白尿(见图1) 。再加上该法采用的染色液敏感性高,尿液不需预先浓缩,可直接进行检测,大大缩短了实验时间,方法最小检出敏感限度为15 mg/ L 。电泳膜片可用光密度扫描仪进行分析,获得尿蛋白电泳图谱及百分含量,对尿液的选择性程度作初步的估计,用于早期肾损伤的诊断和疾病治疗过程中对病情的动态分析有很大价值。
       作者分析了16 例肾活检患者尿液样本,其中11例肾活检提示轻微病变性肾小球疾病,局灶节段性肾小球硬化等肾小球病变,非浓缩尿蛋白电泳图谱显示选择性蛋白尿,特点为尿蛋白分子量都较大,主要成分是白蛋白(占总蛋白的70 %以上) ,并伴有转铁蛋白和少量IgG或IgA ,而IgM,α2-巨球蛋白未出现,提示肾小球滤膜仍保持着选择性滤过的特性;1例肾活检为局灶硬化性肾小球肾炎,提示肾小球滤膜通透性差,电泳显示非选择性肾小球蛋白尿,特点为各类大分子蛋白质都出现, IgG明显增高,更可见到α2-巨球蛋白这类超大分子量蛋白质;另3 例肾活检显示除肾小球病变外又累及肾小管,电泳图谱中大、中、小分子蛋白区带均出现为混合性蛋白尿;还有1 例肾活检诊断为轻微病变性肾小球疾病,电泳图谱上仅得到淡染的白蛋白条带,24 h 蛋白定量仅60 mg ,提示肾小球病变可能已转归。实验结果提示SDS-AGE 与肾活检结果相符。健康对照组尿液在电泳图谱上仅得到白蛋白的淡染条带,或伴有转铁蛋白及免疫球蛋白的痕迹。肾活检虽然对肾脏疾病的病理及免疫分型具有极高的诊断性,但由于肾穿刺属于创伤性诊断技术,可能造成出血,感染等并发症,而且穿刺技术及取材部位也会影响穿刺的成败,因此患者对此顾虑较大,而SDS-AGE 能在无损伤情况下对尿蛋白组份进行分析,用于早期肾损伤的诊断评价,是一种有效的诊断方法。
       本实验还对此16 份尿液样本分别采用SDS-AGE 和SDS-PAGE 二种方法进行比较,结果相符(表1) 。此外,还发现晨尿的结果比24 h 尿更为理想,可能因为晨尿较为浓缩及更酸性,能较充分反映肾损伤的情况,也可避免饮食及运动干扰,保证检测的准确性。
       目前已证实尿中白蛋白、脂蛋白、转铁蛋白、补体和本周氏蛋白等对肾具有毒性作用。白蛋白可通过它携带的分子刺激间质炎症的发展,转铁蛋白被认为是肾小管毒性的一种介质,尿蛋白含量升高,或尿蛋白比例改变,是肾小球损伤最早的临床表现,若已累及肾小管则预后更差[4 ,5 ] 。为此,正确地了解尿液内各蛋白组分的含量及变化对肾脏疾病的诊断,鉴别诊断,指导治疗和判断预后颇具价值。采用SDS-AGE 进行尿蛋白电泳具有敏感性高,不需预浓缩尿液,省时,便于保存,通过光电扫描可半定量分析等优点,值得推广。
参考文献
1 沈霞,主编. 现代生物化学检验与临床实践. 上海:科学技术文献出版社,1999. 119-120.
2 李士梅,主编. 临床肾脏病学. 上海:科学技术文献出版社,1988.159-163.
3 陈梅芳. 尿蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳的临床应用. 中华内科杂志,1997 ,36 :326-328.
4 Le Bricon T , Erlich D ,Bengoufa D , et al . Sodium dodecyl sulfate-a-garose gel electophoresis of urinary proteins : Application to multiple myeloma. Clin Chem, 1998 ,44 :1191-1197.
5 Burton C ,Harris KP. The role of proteinuria in the progression of chronic renal failure. AmJ Kidney Dis , 1996 ,27 :765-775.
                                                                                                                                    编辑：范伟伟