尿液有形成分染色技术的研究及应用进展

狐仙

                                                                                    河北医科大学第二医院检验科     李顺义 魏宏莲
       【摘要】尿液有形成分染色技术对泌尿系统疾病的诊断与鉴别诊断具有重要临床意义。本文介绍了各种改良染色法、细胞化学染色法、荧光染色法及纺织染料染色法的发展概况，并对尿液有形成分染色技术的发展前景进行了阐述。
       【关键词】尿分析；染色与标记

       尿液有形成分检查可以弥补尿液理化检查不足而造成的漏检或误诊。尿液有形成分检查过去被称为尿
沉渣检查，这种检查法对了解泌尿系统各部位的变化，泌尿系统相关疾病的定位诊断、鉴别诊断及预后判断
等有重要临床意义，因此尿液有形成分检查被称为“体外肾活检”[1]。普通镜检法虽可了解尿有形成分的形态学变化，但染色技术则可将尿液中各种有形成分染成不同的颜色，比较清晰地展现某些细胞的细微结构，使尿液中细胞、管型等易于区分，大大提高了对尿中有形成分的准确判断。尿液有形成分染色技术自单一染色、复合染色推出以来，各种改良方法相继用于临床，这些染色技术对泌尿系统相关疾病的诊断与鉴别诊断、预后判断及药物治疗监测等起到了重要作用。近年又相继发展了荧光染色法、细胞化学染色法、免疫细胞化学染色法及纺织染料染色法等，在尿有形成分鉴别中做出了新的贡献。
一、经典染色方法的建立
       1．StenlIleimer-Malbin(S-M)染色方法：是最经典的染色方法，其特点是染色液分为I 液和Ⅱ液。I 液：结晶紫3.0 g，95％乙醇20 ml，草酸铵0.8 g，蒸馏水80 ml。Ⅱ液：沙黄0.25 g，95％乙醇10 ml，蒸馏水
90 ml。应用时将I 液和Ⅱ液按3：97比例混合后过滤即可使用，试剂可保存3个月。染色方法：将尿液离心
后，在0.2 ml 尿沉渣中加应用液1滴，混匀，约3 min后取1滴置载物片上，加盖片镜检。
       S-M 染色方法所染尿沉渣背景比较清晰，尿液有形成分与背景色对比鲜明，红细胞一般呈淡蓝色；白细
胞胞质淡蓝到粉红色，核呈淡蓝到蓝色，颗粒结构清晰并能分类；上皮细胞核呈红色偶有紫色，胞质呈紫红
色；管型中透明管型呈粉红色或紫色，颗粒管型呈淡红到蓝色；细菌为紫色、桃红色或不着色[2]。S-M 方法已被《全国临床检验操作规程》第1-3版推荐使用。
       2．Sternheimer染色方法：是欧洲尿分析小组认为优于S-M染色的方法[3]。其特点是对尿液中的一些有
形成分有较好的染色作用，也分I 液和Ⅱ液。I 液：2％阿利新蓝8GX(Alcain blue-8Gx)水溶液。Ⅱ液：1.5％哌洛宁B(Pyronine B)水溶液。I 液和Ⅱ液各自过滤后，以2：1 的比例混合，可保存数月。红细胞呈粉红或红色，有时未着色；白细胞核呈紫色，胞质呈红色；上皮细胞核呈紫色，胞质呈桃红色；透明管型基质呈蓝
色，粗颗粒管型呈红色粗大颗粒，基质呈红或红紫色，细颗粒管型含有微细红色颗粒，蜡样管型呈红紫色；黏液丝呈蓝色；细菌、真菌、滴虫不着色。
       Sternheimer染色方法对红细胞和白细胞染色清晰，对管型、上皮细胞能进行分类，并可区分白细胞和肾小管上皮细胞。Sternheimer法也被《全国临床检验操作规程》推荐在临床使用。
二、改良方法不断推出
       S-M 染料价格低廉、易得，而且染色方法简单方便，在临床上得到广泛应用，但该法试剂配制后保存时间较短，易产生沉渣，且对尿中某些有形成分鉴别作用不是很大，因此各种改良染色方法随之产生。
       1．改良S-M 染色方法：有研究者将单纯消除尿中非晶形磷酸盐结晶的S-M染色法进行了改良[4]，其配
方为结晶紫15 mg，沙黄4 mg，95％乙醇10 ml 溶解。再加4.44％乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)40 ml，混
合后用2.5 mol／L NaoH调pH至6.8±0.1，过滤备用。配方中加入EDTA能螯合Ca2+、Mg2+等离子，使难溶性非晶形结晶颗粒转为新的钙或镁盐而溶解。改良后的S-M染色法既能消除非晶形磷酸盐结晶对尿液沉渣的影响，又能使病理性物质染成不同的颜色。染色结果证实了消除尿中结晶后，再染色，使有形成分易识别，减少了漏检，提高了检出率。
       2．甲基蓝-伊红染色方法：尿液内有形成分染色方法虽多，但有的染液不易保存。有研究用甲基蓝与伊
红配成新染液，克服了上述弊端[5]。其配方为甲基蓝2.0g，伊红3.5 g，磷酸二氢钾5.0 g，以蒸馏水配成
100 ml 溶液，pH值为5.30±0.05，贮存于棕色瓶中，室温保存。红细胞染橘红色，白细胞染紫黑色或深紫
色，活细胞的颗粒染色浅或不着色，可见变形运动。肾小管上皮细胞核染紫红色，胞质砖红色或暗红色。透
明管型基质呈淡蓝、灰蓝或淡紫蓝色，颗粒管型充满紫蓝色的粗细颗粒，蜡样管型呈紫或紫蓝色，黏液丝呈淡蓝、灰蓝或淡紫蓝色，细菌呈蓝或紫色，真菌不着色。甲基蓝-伊红染色法可以将尿液中红细胞、白细胞、上皮细胞、管型和黏液丝染成不同颜色，并且染液配置简单，保存时间较长。
       3．阿利新蓝-中性红染色方法：由阿利新蓝和中性红2种染料配制而成的染液对尿中的细胞和管型有很
好的染色效果。这种染色法既可用于尿沉渣染色镜检，又可用于自动染色尿分析工作站[1]。其染色特点为
红细胞呈橙黄色或淡红色；白细胞的中性粒细胞活细胞核呈橘红色，胞质内可有布朗运动现象，死细胞核呈
天蓝色，胞质着色较淡，淋巴细胞和单核细胞核呈灰蓝色，胞质呈灰色；上皮细胞核呈橘红色，胞质呈灰蓝色；管型中透明管型不着色或灰蓝色，颗粒管型和白细胞管型呈紫红色，蜡样管型红紫色或深紫色，脂肪管型不着色或淡蓝色；结晶、细菌、真菌不着色。该染色方法对管型、异常红细胞、上皮细胞染色效果较好，为肾脏疾病的早期发现、诊断、治疗提供了新方法。
       4．各种复合染色方法：凡同时应用2种或2种以上染液进行染色的方法均称为复合染色法。过去使用
于血涂片染色的May-Giemsa染色法和wright-Giemsa染色法都可用于尿沉渣固定后有形成分染色。除各种
细胞染色良好外，管型也可显示不同的着色，且染色后的标本可长期保存。巴氏(Papanicolaou)染色法也属
于复合染色法，其固定标本染色后，不仅分色良好，而且有形成分结构清晰，尤其适用于尿中脱落细胞如肿瘤细胞的鉴别诊断。近年有研究使用核红-亚甲蓝染色法、考马斯亮蓝-中性红染色法、甲苯胺蓝-中性红染色法等染尿沉渣有形成分[2]，这些染色法虽可染尿中各种细胞和管型，但核红-亚甲蓝染色法、考马斯亮蓝-中性红染色法、甲苯胺蓝．中性红染色法均不如Sternheimer染色法和S-M染色法的染色效果好。
三、细胞化学染色方法提高了形态学鉴别能力
       细胞化学染色可提高血液系统疾病的诊断水平，同样细胞化学染色也可提高尿液中有形成分的形态学
鉴别能力。
       1．过氧化物酶(POX)染色方法：POX染色技术是血细胞染色中最常用的细胞化学染色法，临床上有
Washburn联苯胺染色法、Pereira碘化钾染色法等。有研究以盐酸联苯胺染色法染尿细胞管型[6]，证明POX染色技术可鉴别粒细胞管型和肾小管上皮细胞管型，前者阳性，后者阴性；同时也能鉴别在直接镜检法中难
以区分的粒细胞和肾小管上皮细胞；且方法简单，准确性高。以3-氨基-9-乙基咔唑法POX染色技术鉴别尿
细胞管型，粒细胞管型强阳性，单核细胞管型弱阳性，淋巴细胞管型、肾小管上皮细胞管型阴性，有助于克服单纯靠形态观察时的主观误差[7]。以联苯胺染色法检查肾小球疾病患者尿沉渣中红细胞管型，经联苯胺染色后红细胞管型染深蓝色，退变的红细胞管型呈深蓝色，霉菌和脂肪球不着色；因此联苯胺染色法极易区别红细胞管型与霉菌管型和脂肪管型，较直接镜检法敏感、准确、快速、检出率高，有助于对血尿患者肾脏疾病的诊断[8]。联苯胺染色法和盐酸联苯胺染色法虽简便易行，且染色效果好，但联苯胺有致癌作用。碘化钾染色法试剂配制和操作也简便易行，适宜常规使用。
       2．脂肪染色方法：油红O为脂溶性染料，可显示最小的脂滴，易溶于有机溶剂，不溶于水，可优先为脂类从溶剂中吸附染料。苏丹III 乙醇饱和液更容易溶入脂肪，常用于脂肪球、脂肪小体、脂肪管型的染色。以苏丹III 乙醇饱和液染尿有形成分，可使脂肪球染为红或橙红色，脂肪管型也染为红或橙红色。苏丹III 染色是用于鉴别脂肪类成分比较方便的染色方法。
       3．酸性磷酸酶染色：酸性磷酸酶染色技术也是血细胞染色中最常用的细胞化学染色法之一，有偶氮偶
联法和Gomori 铅法。尿有形成分中管型染色常用Gomori 铅法，肾小管上皮细胞管型酸性磷酸酶染色呈棕
黄色阳性反应，肾小管上皮细胞也呈阳性反应。过氧化物酶染色阴性和酸性磷酸酶染色阳性有助于识别肾
小管上皮细胞管型[6]。酸性磷酸酶染色也有助于鉴别肾小管上皮细胞和前列腺细胞。酸性磷酸酶染色同时能区分透明管型和颗粒管型。
       4．含铁血黄素染色：含铁血黄素染色法最早由Rous 根据普鲁士反应原理而设计，主要用于检测尿有形
成分中含铁血黄素，阳性时可见到分散或成堆的蓝色闪光颗粒，也可见到细胞内蓝色闪光的含铁血黄素颗
粒。可辅助诊断慢性血管内溶血性疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症及阵发性寒冷性血红蛋白尿症等。
       5．其他染色方法：除上述4种常用细胞化学染色法外，也可进行碘染色，用于检出混入尿液中的植物性
淀粉颗粒及动物性糖原。Hansel 染色法可识别尿中的嗜酸粒细胞。非特异性酯酶染色法有助于单核细胞的识别。
四、荧光染色开创了尿有形成分筛查的先例
       UF系列流式细胞术尿有形成分分析仪基于流式细胞术和电阻抗检测原理，并采用羰化氰及菲啶2种荧光染料对稀释标本进行染色。菲啶主要染细胞的核酸(DNA)成分，用于区分有核的细胞和无核的细胞；羰化氰可与细胞膜的脂质成分结合，用于区分细胞的大小。尿有形成分与荧光染料接触后通过鞘流进行激光照射，各种有形成分产生不同的前向角散射光强度和荧光脉冲宽度，又通过电阻抗测出红细胞、白细胞大小散点图、直方图，仪器可自动报告红细胞、白细胞、上皮细胞、管型、细菌5个定量参数及小圆上皮细胞、病理
管型、霉菌、结晶及精子5个定性参数，还可测出尿液电导率指标。流式细胞术尿有形成分分析仪具有无需
离心、检测速度快、病理成分敏感度及重复性好等优点，且便于质量控制及标准化。但这种荧光染色技术只
是一种快速定量分析的过筛手段，其假阳性及假阳性率仍较高。有研究对3种尿有形成分检查方法的敏感
性进行了比较[9]，共随机检测新鲜尿标本1683份。结果显示，UF-100法与镜检红细胞结果不符标本91份，
假阳性率为14.3％，主要原因为尿液中存在草酸钙结晶、类酵母细胞和大量杂菌；UF-100法与镜检白细胞结果不符标本47份，假阳性率为7.2％，主要是UF-100将小圆上皮细胞误判为白细胞；UF-100法与镜检管型
结果不符标本138份，假阳性率为61.6％，主要原因为尿液中存在黏液丝、较多上皮细胞、白细胞、真菌和其他杂质。说明UF系列流式细胞术尿有形成分分析仪只是一种快速定量分析的过筛手段。第二代尿有形成
分分析仪UF-1000i 用于临床以后，虽然较UF-100 型增加了一个专门的细菌通道，而且能显示不同的杆菌散
点图和球菌散点图，可帮助初步鉴别何种细菌引起的尿路感染，有利于指导临床用药。但染色镜检法不仅可
以进行定量分析，还能进行形态学识别。尿沉渣工作站在临床上应用后，对提高形态学检验质量起到了促进
作用。国产UD 自动染色尿分析工作站是一种显微镜式的图文分析系统，仪器内置定量染色装置和染色液。
仪器的染色特点是在检测过程中加入了特殊的阿利新蓝-中性红染色液，使操作者能够更加清晰地辨别细胞
和管型，克服了不染色尿沉渣镜检误认、漏检的缺点，提高了检出的阳性率[1]。
五、纺织染料与尿有形成分检查
       纺织染料可染血细胞是Ehrlich首先发现的，Kass以多种纺织染料染各种血细胞，为临床形态学诊断做出了新贡献[10]。国内李顺义等[11]发现国产纺织染料耐晒黑G的乙醇溶液对粒细胞有特异性着色。朱芸等[12]利用国产纺织染料碱性品蓝染各种血细胞也取得了非常满意的结果。郝冀洪等[13]利用国产纺织染料
碱性品蓝染巨核细胞，同样取得了很好的效果。赵捷等[14]试用纺织染料染尿中有形成分，发现仅用1种纺
织染料可使尿内有形成分染为不同颜色，有利于形态学识别，创立了新的尿有形成分染色法。5％碱性品蓝
生理盐水染液使红细胞呈浅红色或灰红色；白细胞核呈紫红色或蓝紫色，胞质呈灰紫色；上皮细胞核呈紫蓝
色，胞质着色不同，底层细胞胞质呈深蓝色，中层细胞胞质呈灰蓝色，表层细胞胞质呈浅红色；其他细胞和管型也呈现不同颜色，显示了国产纺织染料碱性品蓝独特的染色优点。
六、尿有形成分染色技术的发展前景
       1．加大尿有形成分常规染色法的筛选力度：尿有形成分定量检查推荐法和尿有形成分离心沉淀检查法
均列为《全国临床检验操作规程》规范化尿沉渣检查项目，两者均为非染色技术。为了提高尿有形成分的检
验质量，上述方法若能进行活体染色，则可大大提高对尿有形成分的识别能力，又可防止漏检和误诊。活体
染色除《全国临床检验操作规程》推荐的s—M法和Sternheimer法外，国内先后又推出甲基蓝-伊红染色法、阿利新蓝-中性红染色法、纺织染料碱性品蓝染色法等，这些染色法在尿沉渣染色法中各有优缺点，今后应对上述5种染色法从染料质量、染液成本、染色时间、沉渣干扰、背景颜色、保存期限及染色效果等方面进行优选，使优良的染色法尽早用于尿有形成分常规染色，不断提高尿有形成分镜检质量。
       2．单一染色技术仍有一定发展前途：单染法早已用于各种体液形态学检查，由于其试剂单纯、染料易
得、染色简便及检验结果快速等很受临床欢迎。其中0.5％甲苯胺蓝染色具有细胞核结构染色清晰等优点，
已被国内外学者推荐用于尿有形成分染色观察[15]。单染法虽多，但部分对胞核和胞质分辨不清，且着色单
一，多年来进展缓慢。利用国产纺织染料碱性品蓝染尿中有形成分，使1种染料可显示红、蓝2种颜色，为单
一染色技术开辟了新思路。我国是纺织大国，国产纺织染料众多，许多染料可用于单一染色研究，为进一步
优选活体染色提供了丰富的染料资源。
       3．细胞化学染色对尿有形成分鉴别具有重要价值：尿有形成分镜检法和尿有形成分染色镜检法虽可识
别尿中细胞、管型、结晶、真菌和滴虫等，但不能分析细胞和管型中的化学成分，因此对尿有形成分中白细胞和上皮细胞分类、管型鉴别、脂肪类成分确定及含铁血黄素颗粒的识别等，细胞化学染色技术仍具有不可替代的作用。细胞化学染色有直接染色和固定后染色2种，直接染色简便易行，如脂肪管型染色是在载玻片上先滴尿沉渣1滴，再加苏丹III 饱和乙醇液1滴，混合后即刻镜检。含铁血黄素染色是在尿沉渣中加入2％亚
铁氰化钾液和3％盐酸液，混匀10 min后滴于载玻片上加盖片镜检[1]。今后可多开发这种细胞化学染色技术。
       4．免疫细胞化学染色技术有待深入研究：近年来，许多学者应用单克隆抗体标记技术以荧光染色法或
酶免疫化学染色法检测尿有形成分，发现这类方法可更加清晰地识别尿内细胞和管型，如肾移植排斥反应尿
中淋巴细胞检测、血小板管型鉴别及管型内沉积蛋白质的性质等，都可以通过上述染色技术进行确定，可见
免疫细胞化学染色用于鉴别尿有形成分具有实用价值。今后应扩大研究范围，不断提高尿有形成分鉴别水平。
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                                                                                                                                    编辑：范伟伟