分子诊断中的质量控制

Q伯爵

       分子检测需要严格遵守好的质量控制惯例。最关键的部分是找出如何完成质量控制的方法。
       新的水平结果信息和质量行为规范表明分子诊断检测中的标准质量控制（QC）惯例标准与其他实验室项目的标准QC惯例之间仍存在一定的差距。质量问题已在某些领域中出现，但大部分出现在直接针对消费者（DTC）的检测领域中。例如，最近的政府财政办公室研究所在分析了2009年6月-2010年6月送到四个DTC基因检测企业的DNA样本结果之后，给出了不适当分子检测质量的证据。2010年7月12日提交给代表大会的GAO报告中，比较了15种疾病的检测结果后，观察到每个捐赠者都接受了疾病风险预测，但四个企业中的风险预测结果都是不同的。该结果表明同样的DNA样本会因执行分析的企业不同而出现不同的结果。大会中，FDA也指出了其观察到的重要DTC基因检测失误，包括不可接受的检测临床结果。这些数据表明在许多与DTC检测有关的潜在问题中，不恰当的质量保证项目是一个关键的问题。
       此外，2010年5月美国健康卫生研究与质量机构（AHRQ）“质量、规范和临床实验室开发分子检测实用性”报告中，对水平检测结果进行的国际性总结展示了各种广泛的性能水平。其中一项调查报告的结果中有28%-98%是正确的，另一项调查报告的结果中有94%-100%是正确的。该报告强烈表明临床实验室中的QC惯例是不合格的，与DTC企业中的情况是一样的。
       该报告是AHRQ的要求结果（AHRQ是HHS的健康服务研究附属机构），采用的数据来自各种广泛的文献综述、实验室和专业团体的信息网站以及从政府机构中获得的信息。总结了七个机构中发布的水平结果。调查包含了PCR型检测、荧光原位杂交、综合PCR以及测序方法。其中有四个机构的结果基础是1个或2个调查，而另三个结果的基础是7个或8个调查。整体上来说，85%-95%正确结果是普遍的情况。作者根据最近的调查结果，推断检测质量正在得到逐步的改善。但是，还有相关报道中的正确结果比例低于28%-44%；因此进行准确评估需要更多的水平数据。
       因为水平测试是管理结构用来对实验室性能进行的标准测量，且这些检测结果常被看作是提高分子诊断检测质量需要的证据。获得的水平数据不是最完美的，有些“错误”结果可能是由水平样本本身问题所造成的。但是，分子检测水平项目目前仅能对小部分可获得分子检测进行测试，一般是高容量、稳健的检测。即使目前水平项目中所见错误水平相对较低，但也提醒我们要保证检测的准确性。目前有关可允许分子检测医学误差还没有一致的意见。但以往经验表明零误差的实验室检测是不存在的且大多数情况下有些误差在医学上是可接受的，所以许多专家会对以下观点表示同意：即使AHRQ总结的水平报告中少数最佳调查得到的15%误差率对不可多得的检测或用于指导致命疾病（如癌症）治疗的检测来说也是不可接受的。现存的证据表明水平样本中不常发现的稀有变异的相关检测误差率较高。
       尽管分子检测复杂且需要严格遵从好的质量控制惯例这一点是很明显的，但即使是有经验的、有名望的实验室在随后的管理行为中也存在分子检测质量问题。在一个案例中，为数个患者给出的报告中都存在明显的错误结果；调查研究者将错误原因归于实验室未正确遵守实验室质量控制程序。然后管理团体会对不正确的分子检测质量作出反应。
管理概述
       在美国，分子检测是由FDA以及CMS通过1988临床实验室改进修正案（CLIA）进行管理规定的。CLIA管理运行检测实验室，而FDA管理实验室检测（已评估且认证了大约145项分子检测）。尽管缺乏有力的证据，但质量规定体系（21CFR 820部分）和FDA提交要求的严格性为以下假设提供了可信性： FDA批准或认证的检测可靠性优于没有按照GMP生产的检测。AHRQ报告指出目前存在1400多个分子检测，都是实验室研发的检测（LDTs），还没有受到FDA的管理规定。从基因检测网站上获得的信息提示目前分子检测数量可能大于2000。历史上，FDA已运用“执法自由裁量权”来监督LDTs，从而让实验室在没有FDA审查的情况下根据CLIA高复杂性规程开发和验证自己的检测。不过，2010年7月19日FDA实验室研发检测监督公开会议中，FDA宣布已决定对LDTs执行监督管理权。虽然还不清楚FDA将如何运行该项权利，但有人猜测FDA将重点首先审查的是高风险分子检测，如用于肿瘤诊断中的检测。                                    

       FDA对LDTs采取的首要措施——调整管理被称为体外诊断多变量指标检测（IVDMIA）的复杂检测项目——将纳入新的、更加综合的LDTs管理指南中。作为该目的严肃性的象征，FDA于2010年7月12日-19日给提供LDT检测的实验室发送了19份制裁书信。可以理解地是，实验室工作人员会担心这种附加的监督负担会导致患者无法获得有用的检测，并因FDA审查所费的时间和费用而导致实验室停止研发新的、有价值的检测。
       其他的机构也对分子检测中观察到的明显质量问题做出响应。基因学、健康和社会咨询委员会（SACGHS）的建议提高了分子检测的规范，且最近发表报告建议增加遗传学方面的教育并对健康护理人员进行培训。临床实验室改进修正案委员会（CLIAC）在其2010年9月份的会议中将分子水平检测规范更新主题提上日程。CDC在其发病率和死亡率周刊报告中发表了分子检测的质量保证建议，报告题目为“好的遗传性疾病分子基因检测实验室惯例和条件”。其他的建议将于今年发布。尽管需要更多的数据来更好的明确分子检测误差率，但有充分的证据证明分子检测过程复杂且需要严格的监测。Westgard QC有限公司共同创办人和代表、数本实验室质量管理书籍作者James O. Westgard指出需要将误差率作为建立质量控制计划的一部分来进行了解或评估。误差率是决定质量控制目标和测量成功性的基础。大部分实验室都擅长根据其他实验室项目中高复杂性检测的CLIA实施确认和QC计划，但分子检测QC牵涉到很多挑战，比如如何将传统QC管理用于分子方法中的不完整理解、因缺乏分析软件而实施QC计划时面临的困难、质量控制的缺乏、缺乏检测方法的标准化且FDA批准的检测试剂盒很少。
可获得的指南
       越来越多满足这些挑战的资源正在出现，包括还未决定的CLSI指南MM20“分子基因检测质量管理”和更新的MMO1“遗传疾病的分子诊断方法”。最近发布的由James O. Westgard主编的基本QC惯例包含了质量控制技术应用于分子诊断中的讨论，而AHRQ报告中列举了34份附有分子诊断运行指南和标准的文件——其中16份包含QC和质量保证的详细说明。同时还可从企业同行以及来自分子病理学会（AMP）和美国临床化学协会（AACC）的领导那里获得帮助，生产厂家现在也正努力为质控材料资源提供相应的指南。
       大型分子实验室中，创新正在通过传统防止误差、保证准确检测结果QC计划的实施来影响整体检测性能的有效监测。类似的创新包括采用传统的为化学实验室开发的质量控制技术（包含Levey-Jennings图表的绘图数据），采用Westgard规则来决定什么时候需要采取措施等等。
实验室现在如何实施QC
       Westgard基本QC惯例第19章描述了病毒负荷量检测和最低遗留疾病检测中应用的传统QC管理，且在专家会议中呈现了描述Westgard多规则用于肿瘤标志物和最低遗留疾病检测中的宣传资料。来自匹兹堡大学的宣传资料描述了通过某一Excel项目中QC数据计算和展示来从病毒负荷量检测中获取数据的程序规划，而其中一个分子实验室报道了与生产厂家共同合作来为某些内部分子检测开发自动化QC分析软件的经历。
       有一知名参考实验室见证了溯源定性分子检测数据来鉴定检测系统中偏移或趋势的价值，并报告了开发熟练内部Excel项目提取输出数据来监测其囊性纤维化检测的经验。但是，资源有限的小型或中型实验室无法拿出时间来设置电子表格并输入数据，而且处理数据输入和分析软件的缺乏是他们在分子检测中实施强大QC项目的一个主要障碍。
挑战
       分子检测的质量控制仍是很少见的，且质控品很少是根据GMP规定生产的。CDC赞助举行的基因检测参考物质一致性项目（GeT-RM）从相关的Coriell细胞系库中获取DNA，并在多个志愿实验室内进行检测从而验证他们的性能。GeT-RM还列举了其他质控和参考物质来源；可通过GeT-RM在CDC网站上获得完整清单。AHRQ报告还提供了当前可获得的分子检测质控品和标准清单。虽然基因检测为2000多个疾病列举了分子检测，但GeT-RM站点仅列举了少数高量检测的参考物质和质控品。很清楚地一点是我们还需要更多的质控材料，不过即使当前规范通过鼓励生产厂家进入质控品行业来创建一个更好的市场，针对小数量检测的质控品仍是一个需要面临的重大挑战。
       检测方法标准化缺乏在分子检测中与其他实验室项目相比是一个更重要的问题，因为目前还不存在测量核酸的确定、可溯源性方法。标准化是保证实验室与实验室之间、方法与方法之间获得相同检测结果必不可少的条件。认识到该问题对患者护理会产生重要的影响，FDA要求AACC建立一个程序，让缺乏确定测量方法的检测能够获得统一，那样所有可获得的临床检测给出的临床结果将会是相似的。AACC已于2010年10月底在马里兰国家标准技术研究所主持召开了“通过一致化提高临床实验室检测：国际论坛”会议。NIST及参考物质和测量机构（IRMM）已致力于为所选择的分子检测制定标准参考物质和溯源方法，而世界卫生组织和NIST将很快公布巨细胞病毒（CMW）检测标准。
       标准的制定和方法的一致化是很漫长的过程，但即使在无法获得相关标准的情况下，FDA批准的试剂盒将通过为实验室提供按照GMP生产制造的完整检测系统来提高分子检测质量，并可以详细检查检测的复现性性能。但是，FDA审查也是一个很漫长、昂贵的过程，表现出了分子检测（大部分是低数量检测）的特殊问题。FDA确实意识到了在不牺牲质量的前提下简化审查程序的需要，并在2010年8月公布了两个包含相关建议的综合评价法，强调了三个关键目标：鼓励设备创新、建立一个预测性更强的管理环境、增强设备安全性。
结论
       目前FDA批准检测和LDTs范围内都存在分子诊断的质量问题。虽然制定了相关的程序，但分子检测质量保证方面面临的挑战仍然存在。分子检测缺乏传统QC惯例、软件工具、质控材料、标准、标准化和FDA批准或认证试剂盒等典型的实验室基础设施。CDC增加分子水平检测的努力将对误差率的改善有所帮助，而且它的建议将继续提高整体质量。传统分子检测的QC惯例实施逐渐增加，但还需要广泛采用额外的教育和QC分析软件。质控品和参考物质的可获得性正在继续建立，但新的检测的出现也继续超越这些努力。更加严格的应用规则可能会鼓励进一步的研发，但需要政府资金来加快该过程并为罕见疾病提供质控品。仅仅依靠检测试剂盒不会解决这一问题，但可能会为可靠性质量保证项目的建立打下基础。
       不正确的分子检测结果会为患者及其家人带来尤为严重的影响，付出努力和代价来保证检测质量是合理的。准确性和可靠性的提高必须成为规定者和企业的一个持续目标，从而为最好的患者护理提供高质量分子检测。
                                                                                            编辑：范伟伟