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[质量控制] 谈谈「布病」,说说诊断!

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发表于 2017-7-30 10:10:35 | 显示全部楼层 |阅读模式
作者:福建省疾病预防控制中心  李曲文

布鲁氏杆菌(Brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌,布氏杆菌属有六种:马耳他布氏杆菌(羊型布氏杆菌)、流产布氏杆菌(牛型布氏杆菌)、猪布氏杆菌和狗布氏杆菌、林鼠布氏杆菌、绵羊布氏杆菌。其中引起人类疾病的有羊、牛、猪和狗布鲁菌。布鲁氏杆菌感染引起的布鲁氏病(brucellosis),是一种人畜共患性全身传染病,简称“布病”,又有地中海弛张热、马耳他热、波浪热等称谓。

一、细菌分类

布鲁氏菌属分为6个种19个型,即羊种布鲁氏杆菌(3个型)、牛种布鲁氏杆菌(8个型)、猪种布鲁氏杆菌(5个型)、绵羊附睾种布鲁氏杆菌(1个型)、沙漠森林野鼠种布鲁氏杆菌(1个型)和狗种布鲁氏杆菌(1个型)。对人致病的是牛(B. abortus) 、羊(B.melitensis)、猪 (B. suis)、犬 (B.canis)、绵羊附睾(B. ovis)布鲁氏菌等种,可以通过饮食和受伤的皮肤、粘膜直接传染人类。其中,在马耳他“首秀”的羊种布鲁氏杆菌致病力最强。

二、细菌培养   

布氏杆菌为需氧或微需氧菌,最适生长温度37°C,最适PH为6.6-7.4,牛种部分型别、绵羊附睾种布氏菌需在5-10% CO2 条件下生长,初代分离菌株最好在CO2 条件下培养。在普通培养基上生长不良,需用肝汤、胰蛋白胨肉汤、马铃薯培养基、巧克力平板或特制的布氏菌培养基上生长。此菌生长缓慢,初代培养常需5-10天甚至20-30天可见生长。不过实验室长期传代保存的菌株或增菌液,培养24-72h即可生长良好。

2.1

2.1

图1、布鲁氏菌菌落形态


三、鉴定

1.镜检:革兰阴性球杆菌或者短杆菌,大小为(0.5-0.7um)×(0.6-1.5)um,两端钝圆,单个或者成对、短链排列,无鞭毛,无芽孢,不形成真正荚膜,光滑型有微荚膜(如下图)

2.3

2.3

图2、革兰染色镜下形态


2.生化反应:氧化酶阳性,分解葡萄糖,不分解阿拉伯糖和半乳糖,触酶、尿素、硝酸盐还原阳性,动力、硫化氢、吲哚、甲基红、精氨酸双水解酶试验阴性。

3.血清凝集实验:布鲁氏菌菌有A、M和G三种抗原成分,G为共同抗原,一般牛种菌以A抗原为主。A与M之比为20:1;羊种菌以M为主,M比A为20:1;猪种菌A:M为2:1。制备单价A、M抗原可用其鉴定菌种。

4.全自动生化鉴定仪:应用全自动微生物鉴定仪可以鉴定到种,如用Vitek2 Compact 中GN卡进行鉴定。

5.布病血清学检测

1)试管凝集反应(SAT):生理盐水稀释待检血清至 1:25、1:50、1:100、1:200,1:400倍比稀释, 加入0.5ml抗原稀释液,摇匀,放37℃温箱中24小时观察结果。判定结果:每次需配制抗原比浊管作为判断依据。凝集价在1:100(++)以上者为阳性,1:50(++)为可疑。

可作为布氏菌病早期诊断及确诊实验,每份待捡血清需作1个血清对照,以排除血清的自然凝集。

2)虎红平板凝集试验(RBPT)

所用抗原是用虎红(四氯四碘荧光素)色素染成的一种酸性抗原,具有克服非特异性反应,对检查小分子抗体IgG较为敏感的特点。在清洁的玻片上加0.03ml的受检血清,然后再加入上述标化抗原悬液0.03ml,使充分混匀,在4分钟内观察结果,以出现可见的凝集反应为阳性。可作为初筛实验。

3)布氏菌素皮试试验(疫情,必要时):机体接触过抗原,处于敏感状态,可以直接检查。变态反应原是由菌体提取的、以蛋白为主的生物性抗原。皮内注射抗原后,反应出现迟缓。一般在6小时以后局部开始浸润,表现为红、肿。④不能在同一机体重复,有时出现假阳性、假阴性。

6.分子生物学分型方法:

1)属基因水平:
BCSP31基因PCR方法,223bp
B4:5`-TGGCTCGGTTGCCAATATCAA-3`
B5:5`-GCTTGCCTTTCAGGTCTG -3`

2)种水平的鉴定(AMOS-PCR)

⑴ B. abortus-specific primer :
A: 5`-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3`

⑵ B. melitensis-specific primer :
M: 5`- AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA

⑶ B. ovis-specific primer :
O:5`- CGGGTTCTGGCACCATCGTCG-3`

⑷ B. suis-specific primer :
S:5`- GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3`

⑸ IS711-specific primer :
IS:5`- TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3`

2.4

2.4

图3  电泳图


1-5 AMOS基因扩增:1、阴性对照;2、羊;3、牛;4.猪;5、待检菌(羊)
6-10 BCSP31基因扩增:6羊;7牛;8猪;9绵羊附睾(B. ovis);10待检菌(羊)

7.分子分型

1)脉冲场凝胶电泳(PFGE):内切酶:XbaⅠ.

2) 多位点可变数目串联重复序列分析( MLVA ):选取重复序列的16个位点,通过核酸提取、PCR扩增、电泳、BioNumerics软件分析进行分型。根据串联重复序列两端不同的基因组序列设计引物,扩增包含的片段,根据长度计算串联重复次数,串联次数的改变是细菌在繁殖过程中错配和重组产生的。

8、实验室生物安全和质量控制

1)强毒菌株、疫苗菌株、弱毒菌株均可能造成人体感染,但所需菌量会有较大差别。

2)布氏菌是高致病性菌株,布氏菌的抗原制备、菌种保存(冻干)在BSL-3实验室进行。未知标本分离菌、少量菌株实验、弱毒菌株的实验操作在BSL-2实验室进行。布病血清学实验可以在BSL-1实验室进行。

3)严格的菌种接收 鉴定、 保存、 使用和销毁制度。

4)建立风险评估和应急预案。


【本文系作者李曲文授权检验视界网发表,并经检验视界网编辑,转载请注明作者、出处和本文链接

<div class="keytags">关键词:布鲁氏杆菌革兰阴性球杆菌
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