用LC

孤独狼

医学实验室测定的结果对于临床诊治和公共卫措施都具有关键的作用，而建立参考方法（Reference Measurement Procedure, RMP）的目的就是维护测定的准确性和始终可以得到能比拟的测定结果，RMP可以用在下列方面：
        （1） 测定质控外标和内标样品的靶值；
        （2） 用于试剂盒和测定仪器的校准；
        （3） 当多家实验室对一特定人群进行检测时，提供统一的参考范围；
        （4） 评价体外医学检测设施的运行状况；
        （5） 在流行病研究中，是获得可比拟结果的基础。
        下图以测定血清中睾酮为例，说明RMP的地位和作用（图一）。

图一  RMP的位置和作用

        按照ISO Standard 17025:2005，RMP的发展是动态的，它将不断追求最高质量的测定系统，并在不断评估和优化中提高，当更好的测定手段出现时旧的方法也将被取代。LC-MS/MS因此也愈来愈多的被用于对许多分析靶标的RMP中，与此同时，由于质谱仪器的持续改进和其自动化、高通量的特点不断提高，质谱也愈来愈多地被用在了常规检验中。但是应该强调，虽然“参考方法”和“常规测定”使用同一类的仪器和技术，但它们之间是有截然区别的。
        表一列举了质谱在应用于参考方法和常规方法之间的不同。

        质谱的参考方法和常规测定使用同样的仪器，因此会有同样的检测器特异性和灵敏度。但是在参考方法中应该更多地考虑到质量转递（mass transfers）和确认离子（confirmation ion）的配合、使用纯品靶标物进行校准、和将靶标由混合基质中分离出来。
        表二列举了一些例子显示对分析技术的不同运行要求。

        美国CDC所建立的睾酮LC-MS/MS参考方法为例，将其流程图示于图二、HPLC及质谱的运行条件列于表三以供参考。

图二　睾酮LC-MS/MS参考方法流程

        在建立参考方法时需考虑到排除干扰物质的干扰，例如在建立睾酮RMP时所测试排除的干扰物质就有约18种，在此就不一一列举。
        通过上述的努力建立了候选参考方法后，将由JCTLM（Joint Committee For Traceability in Laboratory Medicine）认可。该联合委员会由BIPM、IFCC、ILAC的代表组成，评估参考方法和参考物质，并表列出较高级别的参考物质和参考方法，执行国际间的认可。
        JCTLM评估参考方法是用ISO标准，与此有关的标准和指南有：
        1. ISO17511：有关校准品和质控物质赋值的度量学索源；
        2. ISO15193：对RMP的内容及展示的要求；
        3. ISO/IEC 17025:2006: 对测试和校准实验室能力的要求；
        4. ISO 15195:2003：对参考实验室的要求。
小结
        参考方法在保证临床资料的准确和可信性上是关键性的。
        本文讨论了用LC-MS/MS建立参考方法的主要步骤和要求，并多处以建立睾酮测定的参考方法中的具体实践做为实例。质谱在临床分析的参考方法和常规测定中都是利器，但绝非每个质谱方法都是参考方法，参考方法较之常规方法在遵循ISO17511对分析操作的要求上要严格许多。

说明：本文主要根据Dr. Hubert W. Vesper在“2013年临床生化标准化讨论会暨第9届临床生化检验参考系统年会”上的演讲编写。

                                                                                              姚志建编译