血清叶酸和红细胞叶酸检测的临床应用

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作者：陈朴, 潘柏申
单位：复旦大学附属中山医院检验科

20世纪60年代, 研究人员首次发现了新生儿神经管缺陷症（neural tube defect, NTD）与孕妇缺乏叶酸直接相关[1]。美国食品和药物管理局（U.S. Food and Drug Administration, FDA）在1998年强制规定谷物食品必须添加适量的叶酸, 以此保证怀孕女性即使在不知情的情况下也不会导致胎儿神经管的发育和关闭不全。研究发现除了正常膳食的叶酸摄入外, 在围孕期补充叶酸能够显著降低NTD的发病率[2]。目前, 叶酸水平是国际公认的NTD发病的危险因素。许多国家都强制要求面粉中添加叶酸以减少NTD的发生。我们简单概述了叶酸的代谢、叶酸缺乏症的病因和临床表现, 叶酸缺乏的诊断标准、流行病学研究以及实验室叶酸检测的临床应用。

一、叶酸的生物特性

叶酸也称蝶酰谷氨酸, 是一种核酸、胸苷酸、神经递质、磷脂以及激素合成必不可少的维生素类物质, 在体内作为一碳单位的载体, 参与各种代谢反应。叶酸还是人体必需氨基酸（蛋氨酸）的组成部分, 参与基因或非基因编码的甲基化作用。

人体缺乏合成叶酸的酶, 因此必须依靠外部摄入进行补充。营养学家估计人体内的叶酸贮存量约为10~100 mg。5~10 mg的叶酸能够满足4个月的正常代谢需要。

富含叶酸的食物有绿叶蔬菜、水果、奶制品、谷物、酵母、动物蛋白质等, 但食物的烹饪过程会导致叶酸的破坏。美国膳食参考摄入量推荐成年人的摄入量为每人每天400 μ g, 儿童低于成年人的标准, 妊娠及哺乳期妇女的摄入量应明显增加。加拿大、英国等国家的推荐标准与美国基本相同。天然食物中叶酸的生物利用率约为50%, 强化食品中的叶酸利用率能达到85%, 补充摄入的叶酸制剂的利用率能达到100%。

二、叶酸缺乏的原因

导致叶酸缺乏的原因主要有：（1）营养不良; （2）吸收功能障碍（如吸收不良综合征, 胃大部切除术）; （3）叶酸需求量增加（如妇女妊娠、透析患者）; （4）药物影响, 通过一碳通路进行代谢的癌症治疗药物, 如甲氨蝶呤和5′ -氟尿嘧啶, 可能会导致功能性叶酸缺乏。其原因是这些药物能抑制叶酸通路的关键酶, 如甲氨蝶呤抑制二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase, DHFR）, 5′ -氟尿嘧啶抑制胸苷酸合成酶（thymidylate synthase, TS）。二甲双胍、消胆胺、抗痉挛药和H2阻断剂等药物也能降低叶酸的吸收。

三、叶酸缺乏的临床表现

许多回顾性、前瞻性和随机区组临床试验发现叶酸水平与心脑血管疾病、癌症及认知障碍疾病均相关[3, 4]。目前推断叶酸影响这些慢性疾病的证据尚不充足, 但病理、生理学已证实叶酸缺乏是导致巨幼红细胞性贫血和NTD的主要病因。

1.巨幼红细胞性贫血 叶酸缺乏最显著的量化标志就是血液学的贫血表现。当叶酸量低于红细胞的代谢需要, 骨髓和其他组织中的巨幼红细胞会加速分裂, 并且由于DNA的合成缺陷导致红细胞发生巨幼化改变（巨型红细胞、巨型椭圆红细胞）。维生素B12缺乏也会导致红细胞发生相同的变化。虽然补充叶酸能够逆转维生素B12缺乏导致的贫血, 但不能治疗维生素B12缺乏导致的神经系统疾病, 甚至会加重病情。

2.妊娠期的叶酸缺乏 妊娠期间由于胎儿的胎盘生长和发育、孕妇的血容量增加以及细胞的增殖活跃, 需要补充更多的叶酸。此外, 妊娠期间细胞生物合成的加速会导致叶酸的分解代谢率增加, 并在妊娠晚期达到峰值。胚胎发育早期神经管闭合缺陷导致NTD, 75%的NTD胎儿会发生流产或死胎。这种危害严重的胎儿缺陷性疾病在不同的种族、地域和社会经济环境间有着巨大的差异。NTD的发生受多种基因和环境因素的影响。20世纪90年代初期的2项研究都证实了叶酸补充预防NTD的作用, 围孕期间补充叶酸能有效降低NTD的发生风险已经得到了共识[1, 5]。

四、叶酸缺乏的流行病学研究

一项始于1998年的公共健康调查发现, 强制执行谷物食品强化叶酸后, 美国、加拿大和哥斯达黎加3个国家的NTD发生率分别下降了26%、46%和35%[6]。这项举措的成功促使智利、南非及澳大利亚也开始效仿。目前, 新西兰、英国、爱尔兰以及荷兰的食品安全机构都提倡实行这一举措。

美国全国健康和营养调查（the National Health and Nutrition Examination Survey, NHANES）的数据显示了1988至2004年血清叶酸和红细胞叶酸的变化情况[7], 见图1。在营养强化举措开始实行的最初2年（1999至2000年）出现了继首次调查后的明显峰值变化, 随后的2次调查结果仅呈现了略微的峰值变化。以血清叶酸< 3 ng/mL（< 6.8 nmol/L）或红细胞叶酸< 140 ng/mL（< 318 nmol/L）为缺乏判断标准, 1988至1994年的调查数据发现人群叶酸缺乏的比例分别为15.6%和30.5%; 随后2003~2004年的调查数据发现人群叶酸缺乏的比例已下降至0.5%和4.0%, 其中60岁以上老年人发生叶酸缺乏的概率更低, 仅为0.1%和2.1%。

血清叶酸和红细胞叶酸检测的临床应用

图1 美国营养和健康调查人群血清和红细胞叶酸水平分布[6]

NHANES的调查报告采用的是美国医学研究所（the Institute of Medicine, IOM）的判断临界值, 该临界值最初是基于微生物分析法得到的, 随后的研究使用Quantaphase放射免疫分析法（Bio-Rad Laboratories公司）进行检测。2种方法的结果比对发现Quantaphase法的检测结果偏低35%。如果以比对结果进行临界值调整, 血清叶酸和红细胞叶酸缺乏的比例可低于0.05%和0.5%[8]。

类似的调查发现：一家加拿大社区实验室使用Quantaphase法检测叶酸, 发现营养强化前后血清叶酸缺乏（< 1.5 ng/mL或< 3.4 nmol/L）和红细胞叶酸缺乏（< 95 ng/mL或< 215 nmol/L）的人群比例分别从0.52%和1.78%降低至0.22%和0.41%[9]。而另外一项加拿大汉密尔顿区医学检验中心的研究发现红细胞叶酸缺乏的人群比例仅有0.3%（临界值为< 229 ng/mL或< 520 nmol/L）。

目前, 我国尚未实行食物叶酸强化措施。研究发现叶酸缺乏的比例较高, 且呈地域性差异和季节变化[10]。

五、叶酸缺乏的诊断

1998年, IOM综合文献数据分别将3 ng/mL（7 nmol/L）和140 ng/mL（305 nmol/L）作为血清和红细胞叶酸缺乏的判定值。值得注意的是, 该判定值与叶酸缺乏引起的DNA变化或血液学临床表现不相关。

目前, 叶酸的适宜水平尚未达成统一。为有效防止NTD, 围孕期妇女的红细胞叶酸水平建议达到400 ng/mL（900 nmol/L）。这一结论来自于爱尔兰一项大型病例对照研究的报道, 该研究分析了红细胞叶酸与神经管缺陷发生风险的剂量效应关系, 400 ng/mL（900 nmol/L）的浓度对应的比值比（odds ratio, OR）值为1.0, 此时NTD与非NTD的发生率相同。

尽管有了导则, 但临床医师们在日常解释叶酸结果中依然碰到许多困惑。例如：不同实验室的报告方式不统一, 血清叶酸的结果报告参考区间, 红细胞叶酸则报告判定临界值, 甚至将两者混合报告, 部分实验室还设置了年龄段对应参考区间, 还有以正常、临界或过量的定性结果报告。这些不一致的结果报告方式阻碍叶酸检测的临床应用。

六、血清和红细胞叶酸的检测

叶酸并非是单一分子, 是由一系列的衍生物组成。5-甲基四氢叶酸（N5-methyltetrahydrofolic acid, 5MTHF）是血液中叶酸最主要的存在形式, 约占总量的82%~93%。叶酸检测包括同时测定非代谢性型叶酸（unmetabolized folic acid, UMFA）、四氢叶酸（tetrahydrofolic acid, THF）、5, 10-亚甲基四氢叶酸、5-甲醛四氢叶酸等多种叶酸形式。

20世纪70年代, 临床实验室开始使用蛋白结合法检测叶酸, 在此之前则使用微生物分析法进行检测。目前, 临床实验室广泛使用全自动、非同位素标记的蛋白结合法检测叶酸。但是, 这类方法的检测结果会受到一些因素的影响。例如, 5MTHF与谷氨酸多聚体（polyglutamic acid, PGA）的结合最牢固, 而PGA与叶酸结合蛋白的亲和力明显强于谷氨酸单体（glutamic acid monomer, GAM）; 蛋白量的多少和pH值会影响蛋白的结合; 稀释后的非线性结果等。相对于微生物分析法, 蛋白结合法不受抗菌药物和一些叶酸衍生物（如甲氨蝶呤或甲酰四氢叶酸）的影响。还有多种液相色谱串联质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS）检测叶酸的方法被报道, 但未能在临床实验室广泛应用。

血清叶酸水平受叶酸摄入量的影响, 如果叶酸摄入缺乏, 3周内血清叶酸浓度就会出现下降。红细胞叶酸水平能稳定保持3~4个月, 检测红细胞叶酸水平能更好地反映人体的叶酸储量。二者的检测方法是相同的, 但检测红细胞叶酸需要增加样本分析前处理程序, 同时需要考虑红细胞压积的结果。二者的具体比较见表1。

       

血清叶酸和红细胞叶酸检测的临床应用

叶酸检测目前尚未实现标准化, 同一份样本使用不同生产厂商的检测系统可能得到不一致的结果[11]。CAP关于血清和红细胞叶酸的PT调查结果见图2。检测结果的巨大差异可能是由于各厂商间使用的校准品及叶酸衍生物检测能力（谷氨酸抗原物质）的不同所造成。使用同一参考标准能够降低这种方法间的结果差异, 临床应该谨慎解释不同实验室的检测结果。

血清叶酸和红细胞叶酸检测的临床应用

图2 各厂商方法检测血清和红细胞叶酸结果与参考均值之间的差异

参考文献
1        DALY LE, KIRKE PN, MOLLOY A, et al. Folate levels and neural tube defects. Implications for prevention[J]. JAMA, 1995, 274(21): 1698-1702.
2        LUMLEY J, WATSON L, WATSON M, et al. Periconceptional supplementation with folate and /or multivitamins for preventing neural tube defects [J]. Cochrane Database Syst Rev, 2011, 4: CD001056.
3        RAMPERSAUD GC, KAUWELL GP, BAILEY LB, et al. Folate: a key to optimizing health and reducing disease risk in the elderly[J]. J Am Coll Nutr, 2003, 22(1): 1-8.
4        薛志宏, 王兴宁, 惠玉芬, 等. 血浆叶酸、维生素B12、同型半胱氨酸水平与脑梗死的关系探讨[J]. 检验医学, 2011, 26(6): 423.
5        KIRKE PN, MOLLOY AM, DALY LE, et al. Maternal plasma folate and vitamin B12 are independent risk factors for neural tube defects[J]. Q J Med, 1993, 86(11): 703-708.
6        BERRY RJ, BAILEY L, MULINARE J, et al. Fortification of flour with folic acid[J]. Food Nutr Bull, 2010, 31(1 Suppl): S22-S35.
7        PFEIFFER CM, JOHNSON CL, JAIN RB, et al. Trends in blood folate and vitamin B-12 concentrations in the United States, 1988 2004[J]. Am J Clin Nutr, 2007, 86(3): 718-727.
8        PFEIFFER CM, HUGHES JP, LACHER DA, et al. Estimation of trends in serum and RBC folate in the U. S. population from pre- to postfortification using assay-adjusted data from the NHANES 1988-2010[J]. J Nutr, 2012, 142(5): 886-893.
9        SHUAIBI AM, HOUSE JD, SEVENHUYSEN GP. Folate status of young Canadian women after folic acid fortification of grain products[J]. J Am Diet Assoc, 2008, 108(12): 2090-2094.
10        郝玲, 田熠华, 章斐然, 等. 我国部分地区成年人血浆叶酸的地区和季节差异比较[J]. 中华预防医学杂志, 2002 , 36(5): 308-310.
11        DE BRUYN E, GULBIS B, COTTON F. Serum and red blood cell folate testing for folate deficiency: new features[J]. Eur J Haematol, 2014, 92(4): 354-359.