有关生化分析仪吸光度及校准模式的选择

不才

使用全自动生化分析仪时，如何正确理解测定过程中的自动监测反应的吸光度变化数值。还有对生化项目进行校准时，校准模式的正确选择。
                                南京军区南京总医院检验科汪俊军主任：吸光度的变化是在特定波长下测定某种物质的变化导致的，吸光度在反应过程中的变化，与检测的特定物质在整个反应过程中浓度的变化保持一致。       

        一般情况下，在仪器校准界面，空白校准选择Blank；一点终点法、两点终点法、连续监测法及部分比浊（少于两个浓度点）一般选择2 point；多于两个以上的浓度点选择多点校准（Full）。
                                大连市临床检验中心徐维家主任：1、要了解吸光度的变化，首先要了解参数中主读点：M.DET.Pm/n，也就是Main Detect Point的简写，m和n是主读点区的起止点，0<m<n，也就是说m和n两点是在启动反应后的两个点，m点的读点必须设置，n可以不设置（填写0就是不设置），双试剂中是指R2加入之后的一组时间点，据此计算吸光度速率或平均值用于浓度计算。       

        2.定标方法：
        1）K因素法 又称标准法或者线性法，当物质的浓度和吸光度成比例变化时采用该方法。
        2）非线性法 又称曲线拟合法，当物质浓度和吸光度不成比例变化时使用该方法。
                                重庆市三峡中心医院生化科杜红心主任：使用全自动生化分析仪时，测定过程中的自动监测反应的吸光度变化数值最大用处在于观测是否有前滞反应。对生化项目进行校准时，校准模式应按试剂说明书选择。       

        贝克曼库尔特：自动生化分析对测定过程进行各种自动监测主要有以下几类：
        1．试剂空白监测：每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质：试剂空白的测定方法有两种：
        ①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪。
        ②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪。
        2．样本空白监测：由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果产生非化学反应的干扰。根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，一般是测定样品在600nm/570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度。然后在结果计算时自动减去这部分干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性。
        3．线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性。其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变化速率与连续监测期最后若干点的变化速率进行比较，来判断是否为线性期。
        4．底物消耗的监测：在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。主要用于避免因底物耗尽出现报告低浓度的假象。校准模式的选择主要是生化反应类型来选择，其主要分为以下两类：
        1. K因素法（又称标准化法或线性法）：当物质的浓度和吸光度成比例变化时选用该法。原理是用校准品进行反应，测定吸光度的大小或变化量，根据朗伯—比尔定理（浓度=因素*吸光度）计算出因素（K）的大小，测定待测物质吸光度，利用因素K可计算出待测物质浓度大小和活性大小。K因素法是应用最广泛的校准方法，用于常规生化检验项目的浓度或活性的分析。
        2. 非线性法（又称为曲线拟合法）：当物质的浓度和吸光度不成比例变化时选用该法。其原理是使用多个（3-6）浓度的校准品，在选定波长测定其吸光度值，利用浓度和吸光度之间的关系绘制非线性标准曲线。生化分析仪多采用Logit-log等方法进行拟合计算出曲线各常数。非线性法适用于免疫分析方法，如C-反应蛋白、类风湿因子、抗“O”和酸性糖蛋白等的测定。
        一般生化试剂的参数设定中会有厂家推荐的校准模式。
        迪瑞：1、生化分析仪的原理为紫外可见分光光度法，是根据测定样本、试剂的混合溶液的吸光度值或吸光度的变化率，用朗伯比尔定律来计算待测标本的浓度。通常生化分析仪都会有反应时间的限制，目前通用的反应时间为10分钟左右，即加入样本或R1试剂后测定第一个吸光度到反应液被吸走前最后一个吸光度为10分钟左右，因此在10分钟反应时间内，生化仪会根据没一个测光周期产生很多个吸光度测试值，如反应时间10分钟，测光周期为18秒，所以在整个反应时间内会产生10×60秒÷18≈33个周期，即产生33个吸光度值，在根据试剂设定的测定方法：速率法、终点法、固定时间法等，选取相应的吸光度值或吸光度的变化率用于计算。
        2、通常生化仪校准模式分为以下几类：空白校准、线性校准和非线性校准。空白校准：主要目的是去除反应杯及光路空白的干扰，用于输入因数而无校准品的试剂。线性校准：应用最为广泛，大多数有校准品的比色法试剂，采用空白和校准品的两点校准。非线性校准：用于吸光度变化与浓度变化不成线性的比浊法试剂，采用3-6个校准品的函数校准方式。