糖基化与原发性肝癌标志物

真诚永远

作者：房萌，高春芳
单位：第二军医大学东方肝胆外科医院实验诊断科

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是全球第5位最常见的恶性肿瘤，在全世界男性肿瘤患者致死率中高居第2位。据我国肿瘤登记中心报道，我国肝癌发生率位居全部恶性肿瘤第4位，死亡率仅次于肺癌居第2位，肝癌已成为威胁我国国民健康最主要的恶性肿瘤之一。原发性肝癌中80%以上为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，其余为胆管细胞型肝癌、混合型肝癌、转移性肝癌等。乙型肝炎病毒(hepatitis virus B, HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis virus B, HCV)感染是导致肝癌的主要原因，占肝癌发病病因的80%以上，此外罹患肝硬化、黄曲霉毒素、亚硝胺类物质、酒精摄入过量等都与肝癌发病相关。HCC发病隐匿，但进展迅速，确诊时大多数已处于晚期或已发生转移，导致肝癌患者预后不良。我国肝癌患者的1、3和5年观察生存率分别为27.2%、12.7%和8.9%，5年相对生存率为10.1%[1]。因此，高效肝癌标志物的应用对于实现肝癌的早诊早治、降低死亡率具有重要意义。

一、肝癌诊断血清标志物现状

虽然病理组织学检查是PLC诊断的金标准，但存在样本不易获取、肿瘤具有异质性、有创伤风险等缺陷。在非创伤性的血清诊断标志物中，AFP仍然是目前肝癌早期诊断中应用最为广泛的标志物，其敏感度为60%～80%，但小肝癌仅为40%左右，且在慢性肝炎及肝硬化患者中也常出现AFP的升高。鉴于AFP灵敏度和特异度不高，可用于HCC高危人群筛查和早期诊断的新型标志物研究迫在眉睫。近年来不断涌现出许多新的诊断标志物，如甲胎蛋白异质体(alpha－fetoprotein lens culinaris agglutinin 3，AFP－L3)、脱－γ－羧基凝血酶原(des－gamma－carboxy prothrombin, DCP)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican－3, GPC3)、高尔基蛋白73(Golgi protein73, GP73)、γ－谷氨酰转肽酶同工酶Ⅱ(gamma－glutamyltransferase isoenzymes Ⅱ，γ－GTⅡ)、α－岩藻糖苷酶(α－fucosidase, AFU)、触珠蛋白(haptoglobin, HPT)等。笔者实验室对DCP进行了大样本临床应用评估，发现DCP与AFP联合应用可显著提高HCC诊断效率，对于AFP阴性HCC患者的诊断和随访有很好的补充作用。另外，随着分子生物学技术的发展，大量新型标志物被筛选出并有望进入临床应用研究，如分泌蛋白DKK1(Dickkopf－1)、血浆microRNA谱系、血浆CpG岛标记物、血清N－糖组学标志物等[2,3,4]。

二、糖基化与肝细胞癌标志物

糖基化作用(glycosylation)是蛋白质翻译后修饰中最常见的方式之一，人血清中约50%的蛋白都具有糖基化修饰。糖蛋白糖链在细胞识别、细胞间信号传递、细胞迁移、增殖及分化中均具有重要作用，因此异常糖基化与肿瘤发生发展的关系已经成为恶性肿瘤诊断与治疗的研究热点，在多种肿瘤中均发现异常糖基化形式的存在。HCC患者血清中异常糖基化形式主要包括α－1，6核心岩藻糖、α－1，3分支岩藻糖、多分支糖链(三天线、四天线及以上)及唾液酸水平的升高。特别是血清中α－1，3分支岩藻糖基化多天线糖链水平的升高，不仅可作为HCC的诊断标志物，且与HCC患者的术后生存期相关[5]。目前糖组学检测技术主要有高效液相色谱、质谱技术、液相色谱串联质谱、毛细管电泳、基于DNA测序仪的荧光糖电泳(DNA sequencer－assisted flurophore－assisted carbohydrate electrophoresis, DSA－FACE)、凝集素芯片等[6,7]。本课题组前期采用DSA－FACE技术对HBV相关的HCC、肝纤维化患者和正常对照进行血清N－糖组分析，筛选出α－1，3分支岩藻糖基化三天线糖链作为HCC的血清N－糖标志物，通过logistic回归建立的N－糖与AFP联合诊断模型较单独采用AFP可提高HCC诊断正确度约8%[8]。目前，质谱等分析技术基于糖蛋白的糖链酶解和富集基础上，可对糖链丰度进行定量检测，但仍存在操作复杂、对技术人员要求高、成本高、耗时较长、后期处理分析困难等缺陷，难以在临床实验室推广。因此，开发新的快速、敏感、准确性高的高通量自动化糖链检测技术，如微型毛细管电泳仪、微流控芯片技术等，是糖链作为HCC标志物在临床实验室转化应用的关键。

糖基化水平异常与糖基化代谢酶表达水平密切相关。HCC中发现的异常表达的糖基化修饰酶主要有α－1，6核心岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase 8, FUT8)、α－1，3岩藻糖基转移酶、α－岩藻糖苷酶、N－乙酰氨基葡萄糖转移酶－V(N－acetylglucosaminyltransferase V, GNT－V)、α－2，3－唾液酸转移酶(alpha 2，3－sialyltransferase, ST3Gal)及α－2，6－唾液酸转移酶(alpha 2，6－sialyltransferase, ST6Gal)等。岩藻糖基转移酶种类众多，其中FUT8是催化核心岩藻糖基化合成的关键代谢酶，也是催化AFP形成AFP－L3的关键酶，HCC患者血清及肝脏肿瘤组织中均发现FUT8表达的上调。GNT－V活力升高导致多天线糖链水平的增多，肝癌细胞系HepG2中GNT－V的高表达与其高转移倾向相关，HCC患者GNT－V的高表达可协助预测HCC的TNM分级及肝内肝外转移[9]。唾液酸转移酶ST3Gal I可调控HCC细胞系的细胞黏附作用，与肿瘤转移密切相关，而ST6Gal I活性及mRNA表达水平在HCC中升高，ST6Gal I可通过改变细胞表面受体的糖链结构从而调节其生物学功能，并参与促进肿瘤细胞的迁移和侵袭等，还可通过调控干细胞表型从而促进肿瘤形成[10]。本课题组前期对FUT8的组织和细胞学水平研究发现，HCC癌组织中FUT8较癌旁组织高表达，且干扰肝癌细胞系中FUT8表达后可显著抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移，进一步说明了FUT8与肝癌的发生及转移密切相关[11]。目前除血清α－岩藻糖苷酶(AFU，FUT8的逆向酶)已作为HCC的辅助诊断指标应用于临床实验室检测外，大多数糖基化代谢酶检测仅用于科研。目前糖基化代谢相关的酶学检测主要有生物测活及免疫学检测两大类，目前AFU的检测主要采用免疫学检测法，但方法学线性窄，肿瘤－非肿瘤差异小，作为肝癌标志物应用有缺陷。目前尚没有商业化的FUT8检测试剂。血清中糖基化代谢酶水平及酶活性高低对HCC诊断的应用价值仍需进一步评估，其检测技术也需进一步优化。

三、糖基化特定蛋白作为肝癌标志物的研究和应用

肝脏是糖基化及蛋白合成的重要场所，因此异常糖基化修饰的蛋白类物质作为HCC的诊断标志物更具有理论意义及检测试剂研发的可行性。异常岩藻糖基化是HCC中最重要的异常糖基化修饰，最早发现并成功应用于临床的HCC岩藻糖基化蛋白类标志物当属α－1，6核心岩藻糖基化甲胎蛋白，即甲胎蛋白异质体(AFP－L3)，是蛋白异常岩藻糖基化作为肿瘤标志物的典范。除AFP外，转铁蛋白、α1－抗胰蛋白酶(alpha－1－antitrypsin, A1AT)、血色素结合蛋白、胎球蛋白A、铜蓝蛋白、触珠蛋白(haptoglobin, HPT)、GP73等也存在α－1，6核心岩藻糖基化水平的升高[12,13,14]。另外，研究还发现血色素结合蛋白、A1AT、HPT等蛋白的α－1，3分支岩藻糖基化水平在HCC中也呈升高状态，特别是双岩藻糖基化多天线糖基化修饰的HPT，可有效鉴别肝硬化和HCC[15]。HCC中唾液酸化修饰升高的糖蛋白主要有对氧磷酶1(paraoxonase 1, PON1)及AFP等[16]。此外，HCC中还存在多天线糖链水平的升高，提示复杂糖型的糖蛋白作为HCC血清诊断标志物的可能。笔者实验室建立了凝集素－抗体夹心酶联免疫技术(lectin－enzyme linked immunosorbent assay, lectin－ELISA)用于HCC糖基化蛋白标志物的检测，发现岩藻糖基化胎球蛋白A可作为HBV相关的肝硬化和HCC的诊断标志物[17]，另外，首次发现免疫球蛋白核心岩藻糖基化水平(fucosylated－immunoglobulin G, Fuc－IgG)对于AFP阴性肝癌患者的诊断有很好的补充作用，具有高水平Fuc－IgG的患者生存率更差，提示Fuc－IgG也是很好的HCC术后监测和预后评价指标[18]。目前糖基化特定蛋白的检测主要依赖凝集素层析、lectin－ELISA等。Lectin－ELISA技术具有ELISA检测的快速、简便、灵敏、准确的优势，但也存在无法进行自动化检测、重复性不高、线性范围有限等缺点，临床应用前景受限，开发准确性高、高灵敏度及高通量的自动化检测技术是糖基化特定蛋白作为肝癌标志物在临床实验室得以广泛应用的关键。

综上所述，糖基化的改变与原发性肝癌的发生和进展密不可分，异常糖基化产物作为肝癌标志物在原发性肝癌的早期诊断、动态监测、疗效评价及预后评估中具有重要潜在应用前景，其临床转化应用将为实现肝癌的早期诊断甚至干预治疗等提供新方向及新手段。

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