艾滋实验室检测的那些事

大山

作者：《国际检验医学杂志》编辑部  方琪
目前检测HIV的方法有100多种，总体来说可以分为抗体检测和病毒检测两大类。病毒检测包括细胞培养(病毒分离)、p24抗原检测和病毒核酸检测。

抗体通常是在感染后3～8周能够被检测出来。目前，大多应用双抗原夹心法，这种方法具有很好的灵敏性和特异性。抗体检测由初筛和确认试验组成，初筛试验呈阳性的必须进行确认试验。酶联免疫吸附分析(ELISA)方法有一定的灵敏度，且操作简单、快速，适合对大量样品的检测。因此是目前临床通用的初筛检测方法。国际上有3种确认试验方法，包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验,目前以免疫印迹试验最为常用。

在窗口期，病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化2～18天被检测到。因此，在血清转化期通过检测p24抗原有着很大的优势，可以作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。

病毒培养是检测HIV感染最精确的方法。一般采取培养外周血单个核细胞(PBMC)的方法进行HIV的诊断。

病毒核酸检测通常是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，具有很高的灵敏度，使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术，能够在HIV感染的前两周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT- PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术，能够在HIV感染的前两周检测到病毒核酸。

（一）艾滋病主要的检测方法：

抗体检测

主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验（IFA）。快速检测法，也称为金标法，也是抗体检测的一种方法，根据免疫层析法的原理，用于HIV抗体检测的定性检测。

抗原检测

用ELISA检测P24抗原,在HIV感染早期尚未出现抗体时,血中就有该抗原存在.由于P24量太少,阳性率通常较低。现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原，来提高敏感性。核酸检测用PCR法检测HIV基因，具有快速、高效、敏感和特异等优点，目前该法已被应用于HIV感染早期诊断及艾滋病的研究中。

病毒分离

常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA刺激并培养后，加入病人单个核细胞诊断及艾滋病的研究中。

艾滋实验室检测的那些事

（二）艾滋病检测方法介绍

1.胶体金法

采用胶体金免疫技术和层析原理，定性测定全血、血清或血浆样本中的HIV1/2型抗体。检测阳性样本时，样本中的HIV抗体与胶体金标记抗原结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的重组HIV-Ag结合形成“Au-HIV(1+2)-Ag-HIV-Ab-HIV(1+2)-Ag”夹心物而凝聚显色，游离的胶体金标记重组Au-HIV(1+2)-Ag则在对照线处与抗HIV单克隆抗体结合而富集显色。阴性标本则仅在对照线处显色，30分钟内观察结果即可。

2.乳胶法

人类免疫缺陷病病毒（HIV1/2）抗体检测试剂盒（乳胶法）采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析乳胶标记技术原理。试剂上含有事先固定在检测区（T）的重组HIV-1和HIV-2型抗原。检测时，将样本滴入试剂的加样孔中，样本中HIV-1，2型抗体与预包被在膜上的重组抗原-乳胶颗粒标记结合物反应，然后，混合物在毛细效应下向上层析，在检测区（T）与固定在膜上的重组HIV-1和HIV-2型抗原反应。如果样本中含有HIV抗体，在检测区（T）会出现红色条带，检测区内出现红色线条表明是阳性结果。如果在检测区内（T）没有出现红色条带，则样本中不含HIV抗体，表明是阴性结果。无论抗HIV抗体是否存在于样本中，混合物都会继续向上层析至质控区（C），出现一条红色条带。质控区（C）内所显现的红色条带是判定层析过程中是否正确的标准，同时也作为检测试剂的内控标准。

3.胶体硒法

利用免疫层析法原理测定血样中HIV-1/2抗体。试剂为试纸条形式。(见下图)

艾滋实验室检测的那些事

(1)滤血纸(加样区);

(2)玻璃纤维膜,膜上吸附着干燥的金标抗原;

(3)硝酸纤维素膜,膜上包被的抗原和抗体呈线状;

(4)吸水纸。

以上各组份首尾互相衔接,因此在(1)处滴加液体标本,液流即向(4)处移动。当液体到达(2)处时，硒标抗原被溶解,与标本中的抗体反应形成复合物。液流继续前移至(3)时,带有硒标记的复合物被膜上的抗原捕获,呈现红色线条。未结合的金标抗原继续前移至(4)处。

4.酶联免疫法（ELASE法）

采用夹心ELISA方法检测血清或血浆标本中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体，预包被高纯度基因重组HIV（1+2）型抗原，可与标本中的抗-HIV抗体反应，加入HRP标记HIV（1+2）型抗体抗原结合，形成抗原－抗体－酶标抗原复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。通过酶标仪检测吸光度（OD值），根据OD值判断HIV抗体的存在与否。

5.WB免疫印迹法

艾滋病确诊实验室常用的方法，主要用于确认试验，当初筛出现阳性时，需采用此方法进行确认实验。基本原理是HIV全病毒抗原经过SDS-PAGE电泳,将分子量大小不等的蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100,再把它直接加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合。加入抗人IgG酶结合物和底物后,即可使有反应的抗原抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果。有报告说，免疫印迹试验的特异性不是很好, 有大约2％的假阳性率，但免疫印迹试验依然是目前最常用的HIV确认试验。

6.核酸检测

随着生物技术的发展,核酸检测得到了人们越来越多的重视,它可直接检查HIV RNA,可在发现血清学变化之前检测HIV感染,而且比P24抗原检测方法更灵敏。简单的说就是病毒感染人体后，一般情况下可通过一系列检测被发现，而最早能被检测到的是病毒核酸。现有的酶联免疫等血清学检测方法检测的是抗原或抗体，而核酸检测技术检测的是病毒核酸，所以能更早地发现病毒感染。HIV核酸检测将艾滋病病毒的检测“窗口期缩短至11天。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT- PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术，能够在HIV感染的前两周检测到病毒核酸。