一个有希望的卵巢癌新标志物——人附睾上皮分泌蛋白4

沉默

作者：蔡徐山 综述1, 朱晴晖 审校2       
单位：1.上海市嘉定区妇幼保健院检验科，2.上海市普陀区人民医院中心实验室

卵巢癌(ovarian cancer, OC)是严重威胁女性健康的恶性肿瘤,发病率和死亡率在妇女恶性肿瘤中分别占第5位和第4位[ 1],在妇科恶性肿瘤中高居第3位和第1位[ 2]。由于OC早期症状隐匿,组织学筛查取材困难,检测方法缺乏,超过70%的患者发现时已为中晚期。90%以上Ⅰ期检出的OC患者可以通过常规治疗痊愈[ 3, 4]。早期OC患者的5年生存率可达95%,晚期则不足30%[ 4]。然而OC的早期诊断率仅25%[ 3],因此寻找合适的血清标志物以提高早期诊断率是提高患者生存率的关键[ 5]。目前临床应用最广泛的OC标志物是糖类抗原(CA)125[ 6],其水平的变化与OC的发生、发展、消退及复发相关,但鉴于其在特异性90.9%时敏感性低于60%[ 7],早期患者CA125的表达率更低[ 8],且其用作早期筛查标志时特异性过低[ 9],显示其作为筛查标志的价值受限。因而诸多学者关注探寻高敏感性和高特异性血清标志物的工作。近年来的研究表明,血清人附睾上皮分泌蛋白4(human epididymis secretory protein 4, HE4)水平在OC的早期辅助诊断、良恶性盆腔肿块的鉴别和复发监测等方面有较好的临床应用价值。现综述如下。

一、HE4的生物学特性

HE4基因的cDNA最早由 Kirchhoff等[ 10 ]从人附睾的上皮远端筛选出来,该基因位于染色体20q12q13.1[ 6],全长约12 kb,由5个外显子和4个内含子组成,HE4基因存在多种剪切方式,编码一种具有分泌蛋白特征的产物,即连于信号肽之后、相对分子质量约13 000、富含半胱氨酸的酸性小分子蛋白[ 11]。HE4含乳清酸性蛋白(whey acidic protein,WAP)结构域[ 11],该结构域含8个半胱氨酸组成的4个二硫键核心区域,故HE4又名乳清酸性蛋白-4-二硫化核心结构域蛋白2(WAP four-disulphide core domain protein 2, WFDC2)。

鉴于HE4含有高度保守的WAP结构域,WAP结构域含一个抑制性环结构,可插入蛋白酶活性结构区以发挥抑制蛋白酶的功能。HE4因此而被推测在天然免疫中有作用,但至今未能证实其具有蛋白酶抑制的功能。尽管HE4的功能尚未明了,但从其在附睾、输精管中的含量和位置,特别是在射出的精子表面仍存在HE4的现象,提示HE4在精子的成熟、贮存及受精过程中均起一定的作用[ 12]。因而最初人们将HE4视为与精子成熟相关的附睾特异性的蛋白。直至1999年,Schummer等[ 13]才发现其在OC过度表达。

HE4属于WAP家族,其基因位于染色体20q12q13.1[ 14],多项研究显示20q13区域含有多个肿瘤相关基因[ 15, 16],编码多种WAP类蛋白(WAP1WAP14),如肺弹性蛋白酶抑制剂(elafin)、分泌型白细胞肽酶抑制物(secretory leukocyte peptidase inhibitor,SLPI)、WFDC1等,均已成为多种肿瘤的候选标志物。

二、HE4的临床应用

(一)作为OC标志物的实验室和临床依据

尽管Kirchhoff等在1991年已发现HE4,但人们对其认识和临床应用研究进展缓慢,直到1999年Schummer等[ 13]和Wang等[ 17]分别运用cDNA array杂交技术分析了不同来源的OC及癌旁组织中的基因表达水平,发现具有蛋白酶活性的HE4 mRNA在OC组织中高表达,而在癌旁组织中不表达,并且在早期OC组织中呈不同程度的表达上调,首次揭示了HE4基因与OC的关系。2003年,Hellström等[ 18]用HE4蛋白免疫小鼠后制备成单克隆抗体,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对绝经后妇女(包括37例OC患者、19例良性卵巢疾病患者和65名健康妇女)血清的HE4和CA125进行双盲检测。结果显示,以健康妇女为对照时,在相同的特异性下,HE4和CA125的敏感性比较,差异无统计学意义,但以卵巢良性肿瘤患者为对照时,在高特异性(100%)情况下,HE4的敏感性(60%)明显高于CA125(13%),对CA125作为OC的筛选工具提出了质疑,从而肯定了HE4作为OC标志物的临床价值。

Drapkin等[ 19]用免疫组化分析发现HE4在OC组织中高表达,且表达与组织类型有关,93%的浆液性癌和100%的子宫内膜癌(endometrial cancer, EC)表达HE4,透明细胞癌仅有50%阳性,黏液性OC HE4阴性;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)确认OC细胞株内源性表达糖基化HE4;用芯片技术分析组织中HE4的表达,显示其在OC癌旁组织、肝癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌、良性肿瘤及其他正常组织中不表达或低表达;由此推断在OC患者外周血中有HE4的分泌,这与Hellström等[ 18]的报道一致。Huhtinen等[ 20]的研究也揭示,与健康对照(40.5 pmol/L)和妇科良性疾病组(45.5 pmol/L)对比,HE4在OC患者血清中明显升高(1 125.4 pmol/L, P<0.001),在浆液性OC患者血清中升高尤甚(2 031.1 pmol/L),小细胞癌略有升高(64.1 pmol/L),但与Draphin等的发现不同的是,他们发现HE4在透明细胞癌和黏液性癌中也呈较高水平的表达(分别为397.6和202.6 pmol/L),子宫内膜样OC升高不明显(70.0 pmol/L)。

(二)HE4和CA125在OC临床的应用现状

1. HE4在OC辅助诊断和鉴别诊断、病情监测和复发转归中的应用 多项研究表明,作为OC的血清标志物,HE4优于CA125。2008年美国Brown大学Rhode岛妇婴医院Moore等[ 21]对233例患者(其中67例罹患侵袭性卵巢上皮性癌,166例为良性卵巢肿瘤患者)术前测定患者血液CA125、可溶性间皮素相关肽(soluble mesothelin-related peptides,SMRP)、HE4、CA72-4、活化素A(activinA)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)水平,并将其与最终病理学结果进行比较。利用Logistic回归模型对所有标志物及其组合进行分析,并用交叉验证分析法评价敏感性和特异性。结果在相同特异性(95%)条件下,HE4的敏感性最高(72.9%),与CA125联合检测时敏感性达到76.4%(95%特异性条件),高于任一单项标志物,特别是对于Ⅰ期OC患者,在特异性95%的条件下,CA125的敏感性为15.1%,而HE4的敏感性可达45.9%。Montagnana等[ 22]对99例妇科恶性肿瘤和40名良性患者进行研究,术前检测血清HE4和CA125浓度,应用受试者工作特征(ROC)曲线分析,结果显示HE4诊断性能明显优于CA125[ROC曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.99、0.91],在特异性为100%的条件下,敏感性为98%。Rein等[ 23]证实,作为在早期OC患者血清中存在的标志物,HE4可提供比CA125检测更高的敏感性和特异性,研制长期稳定的生物标记物测定试剂以及制备多种标记物的样本盘(panel),将可能促成对检出早期OC的高特异性和敏感性的有效筛选的策略。Chang等[ 24]报道,在鉴别OC与妇科良性疾病方面,HE4特异性可达90%100%,CA125的特异性为36%99%,二者结合可达100%;在特异性分别为95%、98%时,CA125的敏感性分别为54%、28%,与HE4结合可分别提高至78%、68%。Park等[ 25]在2 182名健康人的大样本亚洲人群中,确定了HE4 和 CA125的97.5%参考上限分别为33.2 pmol/L (95%可信区间32.234.0 pmol/L)和38.3 U/mL (95%可信区间35.141.5 U/mL)。用此值作为截断值,HE4区分OC与良性妇科疾病的敏感性和特异性分别为90.9%和94.1%,CA125则分别为72.7% 和 94.4%。从年龄匹配的对照组中鉴别OC的ROC-AUC值分别为0.94和0.86,差异有统计学意义。Cramer等[ 26]用前列腺、肺、结直肠和OC筛选试验中心的样本,以评价OC生物学标记。作者用取自180例Ⅱ期OC和660例良性疾病或普通群体对照的样本,进行49个生物标志的测试,在检测性能最好的CA125、HE4、甲状腺素、 CA153和CA72-4等5个指标的敏感性均不低于 95%,特异性在73%40%。Hellström 等[ 27]用ELISA检测了尿液中的HE4,发现在特异性94.4%的条件下,尿液HE4检测的敏感性在Ⅰ/Ⅱ期OC患者中为86.6%,Ⅲ/Ⅳ患者为89.0%,尤其在浆细胞性OC中的敏感性达90.5%,提示尿液HE4水平可用于OC的辅助诊断和病情监测,并发现同批患者的血清和尿液中的HE4水平用于诊断OC时的敏感性相似。Havrilesky等[ 28]对200名OC患者和396名健康者进行了研究,用双抗体夹心ELISA检测血清中的HE4、免疫抑制性糖蛋白(glycodelin)、基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)、SLPI、血浆纤溶酶原激活物尿激酶-R(plasminogen activator urokinase-R,Plau-R)、黏蛋白-1(mucoprotien,MUC1)、抑制素A(inhibin A)、纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)和CA125,无论是用ROC确定的临界值还是用  +2 s作为截断值,就单一标志物而言,HE4均呈现最高敏感性,对早期OC的敏感性为62.4%82.7%,对晚期OC的敏感性为74.6%92.5%。该研究小组还对其中30名OC患者长期跟踪检测HE4、免疫抑制性糖蛋白、MMP7和CA125,发现在提示复发方面有52%病例的HE4升高早于CA125,提前时间在669周,证明HE4无论是在OC的早期诊断还是术后复发的早期发现方面均优于CA125。Anastasi 等[ 29]在一项研究中也对8例OC患者进行了术后监测,发现有5例患者的HE4升高早于CA125 58个月,与Havrilesky等[ 28]的结果相近。Huhtinen 等[ 20]发现,在95%的特异性条件下,HE4和CA125诊断OC的敏感性均为78.6%,而二者联合检测时,敏感性可提高至92.9%。该研究同时指出,HE4在OC和EC等恶性病变中明显升高,但在子宫内膜异位病变中并不升高。因此联合检测HE4和CA125有助于卵巢恶性肿瘤与子宫内膜异位囊肿的鉴别诊断。Bast 等[ 30]综合分析了英国的一项200 000 例妇女的试验结果,该试验在不同的研究小组用30多种肿瘤标志物分别单独或与CA125联合进行OC筛查,其中包括HE4、间皮素(mesothelin)、巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、激肽释放酶[kallikrein(s)]和可溶性的EGFR等。结果显示,20%的OC几乎不表达CA125,包含HE4在内的多种肿瘤标志物联合使用可以使诊断OC的敏感性和特异性提高。Scholler等[ 31]用微粒子包被的ELISA联合检测CA125和HE4,其AUC提升至0.89,与Bast等[ 30]的分析结论相符。HE4有助于早期诊断OC,联合检测HE4和CA125的预测准确性高于单用任一标志物。

2. HE4与CA125联合监测在腹腔肿块患者卵巢恶变风险度评价中的应用 Moore等[ 32]启动了一项多中心前瞻性研究,纳入531例盆腔肿块患者样本,联合检测血清HE4和CA125水平,结合患者月经状态(绝经前或绝经后),通过Logistic回归分析建立了相应的数学模型——卵巢恶变风险度模型(risk of ovarian malignancy algorithm,ROMA),以预测盆腔肿物为OC的风险,此公式可分别计算出绝经前、后妇女的OC风险预测指数(predictive index,PI):绝经前PI=-12.0+2.38×LN(HE4值)+0.062 6×LN(CA125值);绝经后PI=-8.09+1.04×LN(HE4值)+0.732×LN(CA125值);风险预测概率(predicted probability, PP,即ROMA值)={Exp(PI)/[1+Exp(PI)]}×100%。从临床资料确定了绝经前妇女OC高、低风险的ROMA值分别为≥12.9%和<12.9%;绝经妇女OC高、低风险的ROMA值分别为≥24.7%和<24.7%。结果显示,用ROMA值诊断绝经妇女患OC的性能,在高风险组的敏感性为92.3%,在低风险组的特异性为75.0%,绝经前妇女在高风险组的敏感性为76.5%,在低风险组的特异性为74.8%。利用ROMA模型将临床上盆腔包块患者分为罹患OC的高危和低危人群,为OC的早期诊断和改善预后提供了新的手段。Moore等[ 33]还比较了ROMA模型与根据影像学[超声、计算机断层扫描(CT)、磁共振检查]计分、CA125水平和月经状态等3个因素评价OC风险度的恶性指数危险度(risk of malignancy index,RMI)在预测盆腔肿块妇女罹患OC的性能差异,结果显示,在75%的特异性条件下,ROMA和RMI的敏感性分别为94.3%和84.6%,二者差异有统计学意义( P=0.002 9),对Ⅰ期和Ⅱ期OC的敏感性,ROMA(64.7%)也显著高于RMI(85.3%, P<0.000 1)。提示用HE4和CA125双标志计算的ROMA值,在OC风险预测方面的性能明显优于CA125单标志和影像学计分的RMI,因此ROMA无论是预测性能还是降低医疗成本,都不失为一个值得推荐的评估模型。Kim等[ 34]用免疫化学发光分析(immuno-chemiluminescence assays,ICMA)测定HE4和CA125,一项对159例有附件肿块[包括78例上皮性OC(EOC)]的女性和224名健康对照进行的研究中揭示,在有附件肿块的患者中,当2项指标同时测定时,AUC值比单用CA125更高,用ROMA模型可成功地将患者分为EOC高危和低危人群(具有87.5%的敏感性和93.8%的特异性),血清HE4浓度与CA125同时测定,可以提供检出EOC更高的准确性。Montagnana等[ 35]用ROMA模型评价了HE4和CA125联合测定对盆腔肿块患者检出EOC的性能,他们分别对绝经前、后有盆腔肿块的择期手术患者(55例 EOC和49例良性疾病)和49名正常人进行了术前血清HE4和CA125检测。绝经前组的36例良性疾病中有29例经ROMA分级列为低危人群(特异性为80.6%),另15例EOC中有8例经ROMA分级列为高危人群(敏感性为53.3%);绝经后组的13例良性疾病中有11例经ROMA分级列为低危人群(特异性为84.6%),另40例EOC中有33例经ROMA分级列为高危人群(敏感性为82.5%)。在绝经前组,CA125、HE4和ROMA的AUC 分别为 0.60、0.77和0.77;在绝经后组,CA125、HE4和ROMA的AUC 分别为0.84、0.94和0.92。他们认为ROMA模型是一种简单有用的计分系统,显示了对绝经后EOC出色的诊断性能;还认为HE4与CA125联合检测未必比单独应用HE4有更好的性能。Jacob等[ 36]在160例良性疾病、输卵管、腹腔、子宫内膜或卵巢起源的交界性肿瘤/腺瘤患者以及健康对照中比较HE4 与CA125的诊断性能,评价RMI和ROMA,HE4和CA125的临床决定阈值分别为70 pmol/L和35 U/mL。结果显示,HE4在子宫内膜异位症中不升高,比较良性疾病与早期OC和输卵管癌,HE4和ROMA显示了最佳的诊断性能(特异性分别为85.9%、87.3%,敏感性分别为78.9%、78.9%时,AUC 分别为0.86、0.87),HE4主要的优点是其特异性以及对交界性肿瘤、早期卵巢和输卵管肿瘤检出能力的改进,不管是否用RMI和ROMA评价,HE4优于CA125。作者称在临床实践中未见联合检测2个指标较单独检测HE4更有助于OC的诊断。卵巢囊肿在超声影像中与子宫内膜癌相似,在鉴别诊断时有一定难度,Anastasi等[ 37]报道了1例术前藉HE4和CA125分析结合磁共振检查术前区别盆腔肿块特性的病例,该病例为有乳腺癌和OC遗传家族史、显示有盆腔肿块的青年女性。据分析她有50%的BRCA1基因突变携带者的可能性,通过盆腔磁共振检查和血清HE4和CA125的比较分析提供了准确的良性卵巢肿块的诊断。基于这一经验,作者认为在BRCA1和BRCA2基因突变的高危患者中,HE4和CA125分析结合磁共振的筛选程序是值得采用的、在术前区别盆腔肿块良恶性的有用工具。系列研究表明,HE4作为OC的标志物在早期诊断、鉴别诊断、病情监测和术后复发监测中显示出其独特的临床价值。

(三)HE4在其他肿瘤和良性疾病的表达

EC由于缺乏有效的血清标志物,约有30%患者不能被早期发现。多项研究表明,HE4有望成为其新的血清标志物。Moore等[ 38]检测了171例EC患者血清HE4、SMRP、CA72-4和CA125,以156名健康人为对照。发现就单一标志物而言,HE4诊断EC性能最佳,AUC为78.7%(其中Ⅰ期AUC为76.7%),在95%特异性条件下HE4的敏感性为45.5%,而CA125的敏感性仅为24.6%。对ECⅠ期病变而言,HE4的敏感性比CA125高出17.1%。Huhtinen等[ 20]的研究也显示HE4不仅有助于OC的辅助诊断,而且在EC患者血清中也显著升高。在EC患者中HE4平均水平为99.2 pmol/L,尽管较OC的1 125.4 pmol/L水平低,但与卵巢子宫内膜异位囊肿(46.0 pmol/L)、子宫内膜异位症(40.5 pmol/L)比较,差异有统计学意义( P<0.001)。

尽管HE4在诊断和监测OC的作用日渐被认同,但其并非特异性的肿瘤标志物,也不具有器官特异性。Bingle等[ 11]研究证明,HE4蛋白在正常女性生殖道腺上皮细胞内表达,在正常的卵巢上皮细胞不表达,但在呼吸道上皮细胞、肾远曲小管上皮细胞及部分消化道上皮细胞均阳性表达,在男性生殖道附睾及输精管上皮细胞强阳性表达。Park 等[ 39]比较了CA125与HE4对各种妇科疾病和非妇科疾病的诊断性能,CA125和HE4在OC中均升高,CA125在妇科良性疾病中升高,而HE4则未见升高,妊娠妇女的CA125高于非妊娠妇女,而HE4在慢性肾病中见升高。在OC与其他疾病的鉴别诊断中,二者联合应用优于各自单独应用。

Galgano等[ 40]研究也表明,作为肿瘤标志物,HE4除在OC患者血清中明显增高外,在移行细胞癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌及消化系统肿瘤中均有不同程度的表达。有研究显示,在乳腺癌患者的血清中也有一定程度的升高,并非器官特异性肿瘤标志物。因此,为达到筛查要求(敏感性为75%、特异性为99.7%,阳性预测值为10%以上),必须结合其他标志物及超声等检查手段综合分析。

三、HE4检测方法及评价

20年来,学者们在致力于HE4的临床价值探讨的同时,用不断更新的检测方法对HE4从基因表达到蛋白均进行了分析检测。Galgano等[ 40]利用免疫组化的高特异性、高敏感性和定位准确的特点,对人体多处正常组织和肿瘤组织进行检测,揭示了在气管、唾液腺等正常组织和卵巢浆液性癌、肺腺癌、EC等组织中HE4表达活跃,但量化困难。Schummer 等[ 13]报道运用cDNA芯片技术对OC组织中21 500个cDNA进行检测,发现HE4基因高表达。Wang等[ 17]依据5 766个cDNA检测了OC的基因表达谱,结果与Schummer等[ 13]相符。该类方法实现了快速、高通量和微量化等特点,在研究中发挥重要作用,但由于设备、技术要求高,以及其结果与临床符合程度的不确定性,尚未用于临床。为检测血清HE4,Hellström等[ 18]用融合蛋白免疫鼠所得2株单克隆抗体建立了双抗体夹心ELISA。Scholler等[ 31]将HE4抗体包被在微粒上或将抗体生物素化等方式,在一定程度上提高了ELISA检测HE4的诊断性能。Fujirebio-CanAg Dignotics公司研发生产的基于2个不同位点的双抗体夹心ELISA体外诊断试剂盒于2008年在欧盟获得欧洲共同体(CE)认证;在美国获药品食品监督管理局(FDA)认证用于卵巢上皮癌复发和恶化的预后评价;2010年获中国国家食品药品监督管理局批准用于临床,开始在国内一些医疗机构应用。但ELISA测定受操作、加样和设备等多因素的干扰,在临床应用时操作须格外认真细致,倍加注意检测质量。2010年3月,Fujirebio Dignotics公司ARCHITECT CMIA HE4 试剂获美国FDA批准(说明书网址: http://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf9/K093957.pdf)。化学发光微粒子免疫分析(chemiluminescent microparticle immunoassay,CMIA)测定HE4步骤包括:抗HE4包被的磁性微粒子与样本中的HE4结合,洗涤后,加入吖啶标记的、抗HE4另一抗原表位的抗体,形成第2步的反应混合物,再经洗涤后加入预触发液和触发液,产生的化学发光反应以相对光单位(relative light units,RLUs)测量,样本中的HE4含量与ARCHITECT i 光学系统测得的RLU之间存在直接的相关。测定HE4的CMIA的问世使HE4测定实现了自动化。

Ruggeri等[ 41]比较评价了CMIA和酶联免疫法(EIA)检测HE4的性能,CMIA 测定HE4线性甚佳( r>0.999 8),精密度[批内和总变异系数( CV)均<4%]满意,与EIA测定HE4的偏倚为0.4%。ROC曲线分析,在特异性分别为90%、95%和99%时,CMIA对EOC的敏感性分别为89.6%、84.4%和79.2%,EIA分别为84.4%、83.3%和79.2%,CMIA CA125分别为86.5%、76.0%和59.4%。2种方法测定HE4用于ROMA模型分析预测EOC风险的准确度十分接近(AUC分别为87.1%和87.6%),差异无统计学意义;尤其在绝经妇女中,提示2种方法分析HE4相关性好,具有同样的临床价值,而CMIA的精密度更佳。作者认为HE4较CA125更特异和准确,推荐将其作为临床和影像学检查之外鉴别良、恶性卵巢病灶的指标。Park等[ 25]认为新的HE4自动化分析显示了很好的分析和诊断性能。

四、展望

OC的严重危害性激励着学者们不断寻找有效的标志物,从Bast等[ 6]研究CA125开始,各国研究者探讨了包括间皮素、SMRP、CA72-4、HER-2和HE4等众多血清标志物,既往研究特别是以Moore等为代表的研究者进行了大量试验,证明分泌性糖蛋白HE4在早期OC和EC中的高表达,且在血和尿中的浓度明显升高。尽管对中国较大人群的研究尚未广泛开展,大样本分期研究更少,但可以期待,随着对OC肿瘤标志物HE4的深入研究,对其功能的进一步探讨,检测方法的进一步完善,HE4在OC的早期辅助诊断、治疗后监测及预后评估中将得到更广泛的应用,在高发病率和高死亡率的OC的防治中发挥其独特的作用。Hellstrom等[ 42]检索了截至2010年12月1日PubMed等网站的文献,文献提示HE4与CA125联合检测较单用CA125可检出更多的Ⅰ/Ⅱ期浆液性OC;以尿液HE4测定代替血清HE4的测定,便于经常检测,有利于早期检出OC;发现抗HE4抗体在OC患者和某些类型的不孕症患者中出现频率更高。但目前尚无多标志物的样本盘可用于无症状妇女较大人群的筛选,以期在Ⅰ或Ⅱ期检出恶性程度高的OC。可以预期,在未来5年,将更多地关注不同的OC亚型以及恶性程度高的OC。除OC以外,HE4还可能在EC、移行细胞癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤的临床有良好的应用前景。

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