HE4蛋白—一种新的卵巢癌诊断标志物

大山

HE4基因最早是Kirchoff等于1991年在人附睾远端上皮细胞中发现的,并认为HE4为WFDC2基因的编码产物，是一酸性、小的单信号肽和半胱氨酸丰富的多肽为特点的分泌蛋白，是乳酸蛋白（WAP）结构域家族蛋白中的一员，乳酸蛋白（WAP）结构域是由一近50个氨基酸组成的保守序列和以由8个半胱氨酸为特点的4-DSC（four disulphide core）核心区组成，其编码产物为有各种不同功能的小分子分泌性蛋白。该基因位于染色体20q12-13.1, 全长11.78kb左右，由5个外显子和4个内含子组成。Hellstrom 等将基因与蛋白质技术相结合筛选出HE4蛋白, 同样证明HE4是WFDC2基因的表达产物，证明在乳酸蛋白（WAP）结构域中有一抑制性的环结构，可以插入到蛋白酶活性结构区而达到抑制蛋白酶的作用。另外研究表明卵巢癌分泌的HE4是一N-糖基化的分泌型蛋白，分子量约为25KDa，远小于分子量为200-1000Kda 的CA125，这可能是HE4比CA125在卵巢癌早期更易分泌入血的原因。
       

       

       

        研究显示,HE4在女性生殖系统上皮包括输卵管上皮、子宫内膜腺体、宫颈内腺体和前庭大腺和男性生殖系统的附睾和输精管上皮中高表达；在近端气管上皮和腮腺、肾脏近远曲小管、垂体前叶、乳腺导管及结肠上皮中有较高表达；在甲状腺、前列腺、泪腺、外分泌腺及胰脏中有表达；在卵巢组织、胃肠道、肝脏、脾脏、淋巴结、肌肉组织包括心脏、骨骼肌、脑组织，淋巴造血和神经中不表达。Galgano发现HE4在肺的腺癌高表达，在膀胱移行细胞癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌及恶性间皮瘤中度表达；在肺的鳞癌、结肠癌、胃癌、肝癌及前列腺癌肿低表达。
       

        1999年Wang等应用基因芯片、cDNA阵列比较杂交法（Comparative hybridization of cDNA arrays）、RT-PCR、Northern blot（印述法）、免疫组化和组织芯片等方法比较了正常组织和卵巢癌组织、癌旁组织中的HE4基因表达水平，结果显示HE4在正常的卵巢组织和癌旁组织中不表达，而在卵巢癌组织中高表达。
       

        2000年Hough等应用SAGE（Serial Analysis of Gene Expression）方法证实上述结果。2005年Drapkin等应用免疫组织化学法进一步证实了HE4在卵巢癌细胞株OVcar-3、OVcar-4、OVcar-5、CaoV3、SKOV3的血清中有表达，同时分析出HE4在100%的卵巢子宫内膜样癌、93%的卵巢浆液性癌和50%的卵巢透明细胞癌中表达，但在卵巢粘液性癌及正常卵巢组织中不表达。
       

        2003年，美国太平洋西北研究所（Pacific Northwest Research Institute PNRA）的Hellstrom实验室用重组的HE4蛋白免疫制备出HE4单克隆抗体，2H5和3D8。据此创建了检测HE4 EIA的初型。Hellstrom等通过酶免疫法（ELISA）法分别检测了37例卵巢癌患者，19例良性卵巢疾病和65例健康妇女的血清中HE4和CA125的水平，以健康妇女为对照，两者的灵敏度无明显差异；良性卵巢疾病患者作为对照时，在高特异度(100%)下，HE4的灵敏度(60%)要显著高于CA125的灵敏度(13%)，证实卵巢良、恶性肿瘤的鉴别方面其假阳性率要低于CA125，有显著性差异，推测HE4在鉴别良恶性肿瘤方面有重要意义。
       

        随后，领先的肿瘤学诊断公司Fujirebio诊断公司(FDI)宣布，它已经从太平洋西北研究院(PNRI)购买了开发两种新发现的卵巢肿瘤标记物--mesothelin和HE4的许可权，双方展开全球战略合作。
       

        临床前研究已经显示，mesothelin和HE4提高了Fujirebio诊断公司以血浆为基础的化验方法--CA125II的诊断潜力。目前，CA125II已成为卵巢癌管理的护理标准。以这些研究结果为基础，再加上三种卵巢癌肿瘤标记物，可能会使诊断水平大大提高，尤其是在早期疾病的发现方面。
       

        2006年Galgano等应用免疫组化和单核苷酸微小序列法证实浆液性卵巢癌中HE4的表达明显高于其它恶性肿瘤，同时指出，HE4在所有的浆液性乳头状卵巢癌和低分化卵巢癌中均表达，80%的卵巢子宫内膜样癌及卵巢胃肠道转移癌有表达，在卵巢黏液性癌、卵巢性索间质肿瘤和卵巢生殖细胞肿瘤中不表达。
       

        2008年Kobel等回顾性分析了21个候选标记物在不同类型卵巢癌中的不同表达，也表明HE4在卵巢内膜样癌和高分化浆液性卵巢癌中具有较高的表达，而在透明细胞癌和黏液性卵巢癌中的表达水平较低。认为HE4可能是卵巢浆液性癌和内膜样癌的标志物，HE4对不同类别卵巢癌有不同的预测价值。有研究发现HE4同样在子宫内膜样腺癌中高表达，目前还无HE4在其他相关妇科肿瘤中表达情况。
       

        2008年Havrilesky等分别检测133例I、II期和67例III期的卵巢癌病人和395例健康人群血清中HE4，Glycodelin，MMP7，SLPI，Plau-R，MUC1, Inhibin A，PAI-1和CA125的水平，并以HE4水平为对照，结果表明，HE4在卵巢癌不同期别中的敏感性不同，I/II和III期中的敏感性分别为62.4%-82.7% 和74.6%-92.5%，其特异性为86.3%-96.0%，均优于上述任何一项血清标志物。同年Moore等对233例盆腔包块患者（包括67例卵巢上皮性癌和166例良性卵巢肿瘤患者）术前分别测定CA125、可溶性间皮瘤相关肽（SMRP）、HE4 、CA72-4、活化素A、骨桥蛋白、HER2和表皮生长因子受体(EGFR)9种肿瘤标志物血清水平，并和最终病理学结果进行比较,利用逻辑回归模型对所有标志物及其组合进行分析，用交叉验证分析法评价其敏感性和特异性。
       

        结果显示：卵巢良性肿瘤和卵巢癌患者之间各项标志物（HER2除外）水平均有显著差异。就单一标志物而言,HE4诊断卵巢癌的敏感性最高(72.9%)，其特异性为95%；对于不同标志物的组合，相比较而言，CA125和HE4联合检测的敏感性最高(76.4%)，特异性为95%，同时也发现如再联合其他标志物检测,其敏感性几乎没有改变。最后提出，对于鉴别良性肿瘤和I期卵巢癌患者，HE4为最佳单用标志物，联合检测HE4和CA125对卵巢癌的预测准确性高于单用任一标志物，进一步为HE4早期预测卵巢癌提供了依据，随后Moore等对171例子宫内膜样腺癌患者和156例健康人群检测血清HE4、SMPR、CA72-4和CA125的水平，发现在95%的特异度下，HE4的敏感性明显高于CA125，其对早期子宫内膜癌的诊断比CA125更敏感并对预测癌症的复发及预后更有效。
       

        2009年Shah等根据入组患者的家族史和BRCA1、BRCA2将143例卵巢癌患者，124例良性妇科肿瘤患者和344例正常对照者分为普通组和高危组，并分别测定血清中间皮素、CA125和HE4的水平，结果显示在95%的特异度下两组三种标志物的敏感性分别为53.9%和39.0%（间皮素），80.4%和79.4%（CA125），82.9%和87.8%（HE4），同样说明HE4具有较高的预测卵巢癌的价值。
       

        在此基础上，2009年Moore等对531例盆腔包块患者(包括352例卵巢良性肿瘤，129例卵巢上皮癌，22例卵巢交界性肿瘤,6例卵巢非上皮性癌，22例非卵巢癌)检测血清CA125和HE4水平,结合患者月经状态，通过逻辑回归分析建立相应的数学模型-卵巢恶性风险模型ROMA法（Risk of Ovarian Malignancy Algorithm），以预测盆腔肿物为卵巢癌的风险，此公式可分别计算出绝经前、后妇女的卵巢癌风险预测值数：
       

        绝经前预测指数PI=-12.0+2.38*LN（HE4）+0.0626* LN（CA125）
        绝经后预测指数PI=-8.09+1.04*LN（HE4）+0.732 * LN（CA125）
        其中，风险预测概率（PP）：
        PP=Exp（PI）／［1+ Exp（PI）］
       

        通过ROMA法可将75%绝经后为良性肿瘤的患者划入低风险组，将92.3%的卵巢上皮癌和交界性肿瘤划入高风险组，其特异度及敏感度在绝经前、后组分别为74.8%，76.5%和75%，92.3%。这种将临床上盆腔包块患者分为罹患卵巢癌的高危和低危人群的方法,为临床上早发现早诊治，提高卵巢癌患者的预后提供了新的路径。
       

        在中国，HE4血清学检测已经有三家公司取得注册证，分别如下：Fujirebio诊断公司(FDI)的ELISA产品由康乃格(北京)技术咨询服务有限公司在国内注册，并取得进口产品注册证：国食药监械(进)字2009第3402246号。采用HRP标记HE4抗体来定量测定。
       

        雅培公司和Fujirebio诊断公司签署了HE4新卵巢癌标志物用于雅培ARCHITECT®自动诊断分析仪的协议。HE4的使用手册已获得FDA许可，该许可是HE4作为辅助监测EOC患者复发或逐步发病；获得在欧洲联盟内作为辅助估计绝经前和绝经后妇女上皮性卵巢癌风险使用的CE认证标志。该产品在国内也已经取得进口产品注册证：国食药监械(进)字2012第3400313号。测试原理为运用化学发光微粒子免疫检测法(CMIA)定量测定人血清中的人附睾蛋白4抗原。
       

        2008年，Roche Diagnostics GmbH和Fujirebio诊断公司签署了HE4新卵巢癌标志物用于该公司电化学发光平台的应用，并于今年取得了进口产品注册证：国食药监械(进)字2012第3400236号。
       

        相信随着HE4的检测的不断普及，会有越来越多公司的产品会进入中国市场，例如BD公司与Fujirebio诊断公司宣布，双方签署全球协议，将开发与供应肿瘤诊断分析产品。在该协议下，双方将共同研发诊断产品。此类产品将把Fujirebio诊断公司的癌症生物标记用于BD公司的复合试验平台。第一批产品将直接用于卵巢癌生物标记HE4，Fujirebio诊断公司也通过BD诊断系统的TriPath平台，授权BD公司将该公司的其它癌症生物标记，用于BD公司未来的复合诊断产品。
       

        就像NT-proBNP的全球专利属于Roche一样，HE4检测同样属于Fujirebio独有，带来的好处就是各个厂家的正常值会趋于一致，不像肌钙蛋白I, 各个厂家的正常值会差异很大，除了价格因素，应该是一个好事情，毕竟检验的准确性是最重要的。