鼻咽癌中EB病毒的检测——在低风险区的意义

亮仔

摘要
        已发表了几篇关于EB病毒（EBV）感染和鼻咽癌（NPC）进展的研究。根据地方性或非地方性区域，组织学类型的发生率是不同的。潜在EBV感染几乎存在于地方性区域的所有鼻咽癌病例中，但是正常情况下不存在于在非地方性区域更常见的一型癌症中。
        目标：这一以医院为基础的研究目的是分析低风险、非地方性区域鼻咽癌患者和正常人鼻咽肿瘤组织以及外周血中EBV的存在情况。
        方法：鼻咽癌患者和正常人样本中的EBV检测。
        结果：本研究表明外周血中EBV阳性病例的频率在肿瘤晚期较高。
        结论：鼻咽癌发病率有明确的分布。由于该疾病在西方国家的患病率低，所以在非地方性区域这些肿瘤的生物学信息所知甚少。我们观察到鼻咽癌患者组和对照组之间EBV检测在统计学上的显著差异。本研究可能有助于理解低风险、非地方性区域鼻咽癌的生物学机制和EBV感染与此疾病的相关性。
       

        引 言
       

        与其他头颈部肿瘤相比鼻咽癌（NPC）有不同的地理学和种族分布。2000年世界各地报道了64,798个病例而80%以上病例来自亚洲国家，特别是中国和其他东南亚国家。从全球来说这是一个罕见的疾病，北美和西方国家的白人发病率在1/100,000以下。最高发病率在中国南方发现（每年100,000人中有25-30人患病），尤其在广州。
       

        鼻咽癌是头颈部（坏疽性）溃疡的一个不同类型。世界卫生组织（WHO）认为根据分化等级来分鼻咽癌有三个组织学类型。第一型是角化鳞状细胞癌，第二型是非角化鳞状细胞癌，第三型是未分化癌，也叫做淋巴上皮癌-以突出的淋巴细胞性侵润为特点。肿瘤细胞和淋巴细胞之间的相互作用对于第三型恶性癌成分的不断蔓延至关重要。其中，第二和第三变异型是最常见的而且有共同的病原学特点，与EB病毒（EBV）感染有关。由爱泼斯坦和巴尔在1964年命名，EBV是淋巴隐病毒属的一个γ疱疹病毒，在分类学上称人类疱疹病毒第四型，而且男性是它的唯一自然宿主。
       

        原发感染主要在童年期间获得而95%成人有潜在形式的这种病毒存在于宿主B细胞内。该病毒是引起传染性单核细胞增多症的病原体而且它与伯基特淋巴瘤和鼻咽癌的关联也是众所周知的。EB病毒的地方发病率根据所调查的地理区域而变化，在非洲北部（阿尔及利亚和突尼斯）和中国非常高，但在欧洲北部（丹麦和荷兰）就非常低。
       

        鼻咽肿瘤由来源于非角质性上皮细胞的赘生性细胞组成伴随基质炎性细胞侵润，在恶性头颈部肿瘤中有较差的预后。文献研究显示EBV感染于肿瘤细胞群6克隆扩增之前在鼻咽上皮细胞中发生。关于正常鼻咽组织以及变恶性肿瘤前组织活检的研究显示在癌形成早期出现了遗传学改变，这表明EBV上皮细胞的稳定感染需要一个改变的细胞环境。
       

        关于EBV感染和鼻咽癌形成发展之间关联的很多研究也被发表。比较地方性和非地方性区域，组织学类型的患病率是不同的。在地方性区域，第三型代表这种病例的97%以上，但角质性类型在西方国家更常见（约75%）。除了组织学差异，在地方性区域EBV潜伏性感染几乎出现在所有鼻咽癌病例中，不过它一般不出现在第一型癌中-在非地方性区域更常见。
       

        先前由我们发表的一项以医院为基础的研究显示与其他西方国家发表的文章相反，第二型和第三型在葡萄牙北部的患病率比其他组的高，总分析人数为350，其中有93.75%非角质性癌而只有6.25%角质性癌。
       

        本研究的目的是检测非地方性、低风险区域鼻咽癌患者和正常人鼻咽肿瘤组织以及外周血中的EBV。
       

        材料与方法
       

        病人选择
       

        我们审查了来到我院耳鼻喉科的鼻咽癌病例。
       

        我们研究了43个病例以及包含在石蜡块内的碎片，从中我们发现19个未分化鼻咽癌病例有EBV（10个男性和9个女性）（年龄在13-86岁之间）。我们的研究中还包括17个鼻咽肿瘤组织活检和来自32位未分化鼻咽癌患者（年龄在20-71岁之间）的外周血样本以及45个来自没有已知肿瘤疾病的献血者（年龄在18-64岁之间）的样本。
       

        DNA提取和纯化
       

        用200毫升消化缓冲液（TrisHCL（三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐）10mM, KCl（氯化钾）50mM, MgCl2（氯化镁）2.5mM, 0.5% Tween（吐温）20）通过酶消化法提取石蜡块中的病毒DNA。试管在晚间37℃孵育，溶解在95℃孵育10分钟期间被中断。获得的DNA通过苯酚-氯仿纯化并重新悬浮于50毫升二次蒸馏水中。样本冷冻于-20℃环境中供以后使用。
       

        对于外周血样本，我们从每位患者采集了5毫升的外周血放入盛有EDTA的试管中以分离血浆。以1600xg转速分离样本并小心翼翼地从EDTA试管中取出血浆，把血浆转移到聚丙烯试管中。在处理之前它们被储存在-20℃环境中。用Qiagen血液迷你试剂盒（Qiagen公司）提取血浆DNA样本。随后采取的步骤由厂家推荐。我们用200μL血浆通过圆柱提取DNA。用QIAamp组织试剂盒（Qiagen公司），按照厂家推荐的步骤从新鲜组织中提取鼻咽活检样本DNA。
       

        分析石蜡块中样本肿瘤组织中的EBV 。病毒DNA 扩增通过PCR嵌套法实现，使用以下引物（DE 5’ to 3’）：E3-44mer:GCGGGTGGAGGGAAAGG; E5-25mer: GTCAGCCAAGGGACGCG; E3-2PCR:GCCACCTGGCAGCCCTAAAG和E5-2PCR: AGGCTGCCCACCCTGAGGAT。E3-44mer和E5-25mer引物用于第一次PCR反应，E3-2PCR和E5-2PCR用于另一次PCR反应，终产物重184pb。PCR反应用于一个可程序化的温度循环器(Biometra)，加入每个PCR试管中2毫升DNA形成以下混合物：缓冲液1X，1.5mM MgCl2, 0.2mM dNTPS，每个引物0.5mM和1U Taq聚合酶。第一次PCR反应条件如下：94℃持续5分钟初始变性；94℃时持续30秒，循环40次；57℃时30秒和72℃时1分钟，最后在72℃时延长7分钟。2毫升第一次反应产物参与第二次PCR反应。第二次反应参数与第一次相同，除了退火温度从57℃变成50℃。我们在溴化乙锭中3% (w/v)染色的情况下做了一次琼脂糖凝胶电泳并在紫光灯下研究。
       

        活检和外周血肿瘤组织中的EBV分析
       

        新鲜组织和外周血样本中的EBV 检测通过实时PCR 技术实现。选择PCR 引物的方式是使它们与编码病毒聚合酶DNA 的病毒基因组BALF 5区配对。正向和反向引物序列分别是5’ -CGGAAGCCCTCTGGACTTC- 3’和5’- CCCTGTTTATCCGATGGAATG- 3’。荧光探针（VIC5’- TGTACACGCACGAGAAATGCGCC -3’TAMRA)）与一个在PCR引物之间的序列一起使用，由PE应用生物系统（加利福尼亚州福斯特市）合成。用PCR Taq-Man（PE应用生物系统）试剂盒进行PCR反应。简单来说：把来自200μL血浆中的2.5μL DNA提取液加入到PCR混合物中，有血浆、10 mM Tris (pH 8.3)，50 mM KCl， 10 mM EDTA， 5 mM MgCl2， 100 µM dATP， dCTP， dGTP 和 dTTP， 每个引物0.2 µM， 0.1 µM 探针和1.25 U AmpliTaq Gold（PE应用生物系统）。接下来是扩增，从50℃循环两分钟开始，在90℃持续10分钟AmpliTaq Gold活化，95℃持续15秒循环47次以及在62℃时1分钟。整个过程通过ABIPRISM 7300（PE应用生物系统）序列检测器完成。
       

        DNA质量控制
       

        我们做β-球蛋白基因序列PCR 是为了证实扩增DNA 的存在。靶序列是个110pb片断，我们用了以下引物(5’-3’): PCO3:ACACAACTGTGTTCACTAGC; PCO4: CAACTTCATCCACGTTCACC。这个方案包括95℃持续20秒循环40次,55℃45秒和75℃45秒。
       

        统计学分析
       

        用SPSS(vs. 15.0)统计软件做了结果统计学分析。用t-学生检验计算平均值之间的差异。卡方检验被用于对比分类变量的频率。P值<0.05被认为是统计学上的显著差异。
       

        结 果
       

        鼻咽癌（NPC）患者组和对照组样本描述如表1所示。在鼻咽癌患者组，我们用了从石蜡块中鼻咽肿瘤组织以及患病个体的新鲜组织和外周血中提取的样本。在对照组，由没有已知肿瘤疾病的个体组成，我们用了来自外周血的样本。我们调查了总共68位鼻咽癌患者和45位健康对照人士。在患病组中，19个样本来自石蜡块肿瘤组织（平均年龄56.6岁，标准差11.4）,17个样本来自鼻咽癌患者的新鲜组织（平均年龄51.8岁，标准差7.4），还有32个样本来自鼻咽癌患者的外周血（平均年龄48.1岁，标准差11.3）。对照组平均年龄为51.8岁（标准差7.4）。男性和女性的频率：鼻咽癌组分别是73.5%和26.5%，对照组分别是60.0% 和40.0%。
       

        石蜡块肿瘤组织样本中阳性EBV病例发生的频率是84.2%。新鲜组织样本中EBV检测结果显示100%阳性病例发生率，证明了已发表其他研究结果即所有鼻咽肿瘤细胞都有病毒DNA。在鼻咽癌患者的外周血样本中，我们发现53.1%阳性病例发生率。在对照组中，我们没有在健康人士的外周血中发现EBV DNA（表2）。我们在所有被分析样本类型里发现对照组和鼻咽癌患者组(P<0.001)中阳性和阴性EBV病例统计上的显著差异；表2。
       

        表3描述了关系到鼻咽癌患者和对照组性别的EBV阳性和阴性病例的比较结果。 我们发现关于被分析组性别的EBV阳性和阴性病例分布没有显著的统计学差异。根据肿瘤阶段进行EBV检测分析显示虽然此类差异非常接近统计意义阈值(P=0.069)，但是肿瘤分期越晚，阳性EBV病例发生率越高。
       

       

       

       

       

       

       

       

        讨 论
       

        石蜡块中肿瘤组织样本阳性EBV病例发生率为84.2%。虽然阳性EBV病例发生率较高，但是一个人可以预测所有组织中将含有EBV感染细胞。这一结果可能是由于样本的DNA质量和以石蜡块中肿瘤组织碎片样本为基础的病毒DNA提取功效。考虑到样本质量不足，我们使用了嵌套式PCR方案，试图增加检测方法敏感性。事实上，新鲜组织样本的EBV检测结果显示100%阳性病例，证实了已发表的显示所有鼻咽肿瘤细胞都有病毒DNA的其他研究。在鼻咽癌患者外周血样本组我们发现了53.1%阳性EBV病例。在对照组我们在健康人士的外周血中没有发现EBV DNA。
       

        这些结果表明鼻咽癌患者中阳性EBV案例的发生率较高而且相关差异在统计学上是显著的，无论被分析样本的类型是什么（石蜡块样本、新鲜组织和外周血P<0.001）。
       

        近期研究表明鼻咽癌患者外周血循环中有EBV DNA。EBV检测分析与肿瘤分期（表4）相配，显示肿瘤分期越晚EBV阳性病例发生率越高，但是这一差异在统计显著性阈值内(P=0.069)。这些结果表明最晚期肿瘤看似更容易释放EBV DNA或释放更大量EBV DNA进入病人外周血中。
       

        在所有鼻咽新鲜肿瘤组织活检样本中都检测到EBV DNA，这表明所用PCR实时方案是灵敏的而且可以检测出EBV。在近期研究中调查了外周血中EBV检测分析以便评估鼻咽癌患者外周循环血中出现EBV的临床意义。本研究表明在高级研究中在外周血中检测到EBV阳性病例的发生率较高。这些结果可以作为旨在评估测试值作为诊断目的的额外肿瘤标志物的未来研究的基础。另一方面，在以确定鼻咽癌患者血液中EBV水平数量为目的的定量试验的支持下，我们将能够评估病毒水平值作为这些患者的一个预后标志。考虑到方法的敏感性和取样的轻松性这些试验看似有很高的医学价值，在取样过程中唯一需要做的就是采集外周血，这是一种非侵入性的技术，可能符合临床适用性。
       

        鼻咽癌发生率在种族和地理方面有截然不同的分布。由于其在西方国家的发生率低，在非地方性区域这些肿瘤的生物学信息所知甚少，已知大多数研究都以高危人群为基础，这些人群有各自的特点，在其他国家不一定相同。这些肿瘤在世界各地的不平等发生率表明了与遗传和环境因素有关的复杂病原学，而且这两个风险因素在地理分布上有差异，包括环境分布和遗传背景两方面。之前的研究显示EBV需要一种改变了的遗传环境来促进细胞增殖。这样基因档案就可以改变个体对病毒引起的细胞无限增殖化的敏感性，从而调节EBV对于形成这些肿瘤的影响。
       

        结 论
       

        这些结果表明鼻咽癌患者组和无肿瘤对照组之间的EBV研究有差异。本研究有助于理解鼻咽肿瘤的生物学机制以及这些肿瘤与非地方性、低风险区EBV感染之间的关联。