曲霉的实验室检测进展

Q伯爵

作者：北京大学人民医院检验科  张雅薇，王辉

曲霉在自然环境中广泛存在，可引起免疫缺陷人群的机会性感染，主要发生在中性粒细胞减少和接受高剂量免疫抑制剂治疗的患者中。大部分疾病始于肺部开放部位吸入环境中的曲霉孢子，进而引起局部或侵袭性感染。近年来，随着血液肿瘤或移植患者的增多，侵袭性曲霉病的发生率大幅度增长，病死率较高，已成为急性白血病干细胞移植患者感染致死的最主要原因[1]。早期、快速和准确的曲霉检测对患者诊疗、减少临床医疗负担和降低疾病病死率具有重要意义。

曲霉的诊断通常建立在危险因素评估(如器官移植、血液肿瘤和干细胞移植等)、临床症状、影像学检查、组织病理学检查和特殊的实验室检查等基础上。然而，由于曲霉感染的临床症状和体征无特异性、影像学结果在疾病初期可能表现为阴性、组织活检标本较难获得，以及曲霉几乎不能从血培养中分离等原因，目前曲霉的诊断仍为临床难题[2]。因此，掌握曲霉检测方法，了解进展是临床医师优化诊断方法选择并合理解读结果的基本要求。

一、传统检测方法

曲霉感染诊断的金标准是在无菌标本中通过组织学或真菌培养检出曲霉[2]。然而，活检可引发存在凝血障碍的白血病和移植患者更为严重的并发症。对于怀疑真菌感染的患者，KOH压片和化学染色等直接检测方法虽然具有敏感性高和检测时间相对较短等优点，但不能区分其他丝状真菌(如青霉菌属和足放线菌属)，且当镜下形态学表现非典型时，无法提示曲霉感染，极大地限制了诊断的准确性。

曲霉培养的阳性预测值与感染的流行情况有关，即对免疫抑制患者及曲霉地方性流行地区的培养阳性预测值较高[3]。由于曲霉生长菌落的形态学表现多变，且血培养常为阴性，因此培养的敏感性较低。此外，从下呼吸道分泌物、支气管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid, BALF)和痰标本等分离的曲霉难以区分其为定植还是感染[4]，这也是曲霉培养的主要局限性。

二、抗原检测

曲霉的抗原检测主要包括对血清中半乳甘露聚糖(galactomannan, GM)和1，3-β-D-葡聚糖的检测。其中，半乳甘露聚糖试验(GM试验)对侵袭性曲霉病较特异，而1，3-β-D-葡聚糖试验(G试验)主要用于检测其他侵袭性真菌病(如侵袭性念珠菌病)、霉菌(除外接合菌)和卡氏肺孢子菌[1]。

1．GM试验：

GM存在于部分植物与真菌中，是曲霉属细胞壁的重要组成成分，并随着霉菌的生长被释放到外界中。目前，GM试验主要用于曲霉感染的早期诊断，尤其是对血液系统肿瘤和干细胞移植(HSCT)患者具有较高的诊断价值，其敏感性高于接受实体器官移植或免疫功能正常者。GM试验的敏感性和特异性与被检测患者的疾病类型有关[4]。对于非血液病、非粒细胞缺乏或非HSCT患者，GM试验的诊断价值较低，GM可能在循环中被中性粒细胞迅速清除，而导致结果敏感性降低。国外研究显示[5]，GM试验在无侵袭性曲霉感染风险人群中的诊断价值极低，阳性率仅为2%。

曲霉感染早期，可在患者的血清和BALF中检出GM[2]。相较于血清GM检测，GM试验在BALF标本中对曲霉具有更高的敏感性[6]。Maertens等[7]研究发现，与培养法和纤维支气管镜检法相比，BALF标本GM试验对血液病患者侵袭性曲霉感染诊断的敏感性和特异性均超过90%，同时阴性和阳性预测值分别为96%和76%(cut-off值≥1.0)，更高的cut-off值对于避免过度诊断侵袭性肺曲霉病十分必要[8]。除血清和BALF标本外，痰标本对诊断血液系统肿瘤患者的侵袭性曲霉感染也有一定作用[9]。当cut-off值为1.2时，痰标本检测的敏感性和特异性可达到100%[9]。此外，GM试验对预测侵袭性曲霉感染的预后，以及指导临床抗真菌药物的应用和疗效监测具有重要作用。研究显示[10]，HSCT患者的血清GM指数(GMI)水平与其42 d和180 d病死率有关，GMI越高，则病死率越高。

虽然GM试验具有很高的临床诊断价值，但仍存在一定的局限性。例如，β-内酰胺类药物(尤其是哌拉西林-他唑巴坦)能够降低试验的特异性，使结果出现假阳性[4]。最近研究表明，注射用哌拉西林钠他唑巴坦钠(商品名特治星)引起GM假阳性的比例较低[11]，但临床对使用普通成分哌拉西林-他唑巴坦患者的GM结果仍需谨慎。GM检测结果的特异性在幼儿和新生儿中较低，这可能与GM存在于多种食物中(特别是谷类食品和牛奶)，以及消化道屏障改变有关[2]。

此外，粒细胞缺乏患者的预防和抢先抗真菌治疗会降低GM检测的敏感性，导致结果假阴性[9]。曲霉的不同种属也是影响试验敏感性的另一因素，GM检测对非烟曲霉感染的敏感性高于烟曲霉[9]。

2．G试验：

1，3-β-D葡聚糖是存在于所有真菌细胞壁(除接合菌外)的一种多聚糖成分，以酵母样真菌中含量最高，是真菌感染早期诊断的有效标志物。G试验对侵袭性曲霉病的诊断效力低于GM试验[12]，临床上常同时联合真菌培养使用。对于血液透析、并发革兰阴性菌感染、接受多种抗菌药物治疗的患者，G试验的特异性相对较低，可能出现假阳性[2]。

3．免疫层析测流装置(lateral-flow device, LFD)：

在血清中检测真菌抗原是临床诊断侵袭性曲霉病的重要方法，然而由于方法学和检测时间等原因，GM试验尚不能满足临床需求，LFD检测方法应运而生。曲霉LFD试验利用免疫层析的方法检测血清或BALF中的曲霉抗原[13]。该方法可用于单个患者检测，具有操作简单，检测时间较短(仅需15min)等优点。LFD对血液系统肿瘤和实体器官移植患者BALF标本曲霉检测有良好的敏感性和特异性[14]。此外，Held等[15]研究发现，对于HSCT患者的血清标本，LFD在筛查或排除曲霉感染方面与GM试验的诊断价值相同。然而，如果阳性结果需要第2份阳性血清进行确证，则GM试验的敏感性更高。

4．呼气试验：

呼气试验由于试验原理近似呼吸病理，以及标本易采集等优点，已成为诊断肺部疾病的重要方法。目前，2-戊基呋喃(2-pentylfuran，2-PF)是诊断肺曲霉病较有前景的标记物之一，可在定植或感染烟曲霉的支气管扩张和肺囊性纤维化患者的呼出气体中被检出[16]，但2-PF用于临床诊断和监测侵袭性曲霉病的有效性仍需进一步研究。

三、分子生物学检测

随着分子生物学技术的快速发展，PCR、测序和质谱技术等蛋白质组学和分子生物学方法能显著提高侵袭性曲霉病诊断的敏感性和检测速度，具有较好的临床应用前景。但由于分子检测方法尚需标准化，因此目前主要作为常规检测的辅助手段。影响分子检测方法选择的因素主要包括[3]：(1)真菌的地区流行病学数据；(2)感染部位；(3)标本的选择；(4)不同标本中提取真菌DNA的方法；(5)真菌靶基因的选择；(6)扩增和检测方法。

1．PCR技术：

近年来，PCR技术被广泛应用到曲霉的检测中，但结果存在异质性，原因除方法学存在较大差异外，定义PCR阳性结果的标准不同也是导致研究结果不一致的重要原因[17]。某些研究者仅通过一次PCR检测阳性结果来计算敏感性和特异性，而部分研究者则以至少两次的PCR结果阳性作为PCR阳性。Mengoli等[18]将两种标准进行分析比较，发现二者敏感性没有变化，但后者的特异性更高。

目前，PCR可检测多种临床标本的曲霉。呼吸道标本(如BALF和痰标本)是侵袭性曲霉病最常见的标本，BALF标本的敏感性优于血标本。值得注意的是，BALF标本不能区分定植和侵袭性感染，但阴性PCR结果可排除侵袭性曲霉病[17]。对于全血、血清或血浆标本进行PCR是否可用于血液系统疾病高危人群曲霉感染的筛查仍存在争议。全血标本进行PCR的敏感性高于血浆，血浆中的抗凝剂能够通过抑制PCR反应中酶的活性，显著降低PCR反应的敏感性，其中以肝素或枸橼酸钠的抑制作用最大。其他PCR适用标本包括脑脊液、组织和尿液等。

大多数真菌PCR以多拷贝核糖体DNA(rDNA)的基因群(包括18S、5.8S和28S)及ITS(包括ITS1和ITS2)中的一个或多个区域作为目标区域进行扩增。这些区域包括了高度保守和可变的区域，可据此设计真菌通用引物和曲霉种或属的特异性引物进行鉴定。PCR诊断的主要不足在于较难区分感染和定植。Li等[19]研究证实，利用荧光定量PCR的方法对曲霉28S-ITS2区域特定基因进行检测，可得到较好的敏感性和特异性，是诊断侵袭性曲霉病的有效方法。

此外，研究显示，GM试验与PCR方法结合能够极大地提高临床对侵袭性肺曲霉感染诊断的特异性和敏感性，具有较好的诊断价值[12]。PCR技术以其快速、经济、鉴定到种水平，以及同时检测耐药基因等特点，在诊断侵袭性真菌病方面较有前景，但目前仍需进一步研究以实现标准化。

2．其他新型分子检测方法：

目前，研究者已设计多种分子方法应用于曲霉的检测，以辅助和提高PCR的检测能力。例如，荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、基于核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、质谱技术和基因芯片等。

NASBA方法与PCR技术极为相似，不同的是该方法通过RNA聚合酶扩增mRNA，且试验过程恒温。Yoo等开发了一种实时NASBA，用于血标本中曲霉的检测，其敏感性和特异性分别为100%和43%，该方法可能用于曲霉感染高危人群的筛查。随后，研究者发现该方法还可用于评估临床结局，其阴性转归与侵袭性曲霉患者的生存率存在重要相关性[9]。

质谱技术因其耗时短、成本低、通量高等优点越来越多地应用到真菌诊断中。该方法通过将未知真菌的光谱与数据库中的已知菌进行直接比对，分析鉴定其蛋白指纹，结果可达种的水平。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术的标准化是保证结果可靠的必要条件，特别是对于丝状真菌而言，真菌生长情况及其蛋白提取等都将影响结果的可重复性。

研究显示，MALDI-TOF-MS技术具有良好的前景，能够准确快速的鉴定出念珠菌和曲霉，与传统培养具有较好的一致性(>90%)[20]。值得注意的是，基质辅助激光解吸/电离(MALDI)系统在光谱分析前，需要进行蛋白提取；而目前一些新的方法(如Vitek MS系统)可通过单个沉积的方式以避免甲酸溶解，使检测更快速方便。此外，有学者发现了一种新的MALDI方法用于快速检测曲霉属对卡泊芬净的敏感性[9]。该方法通过检测暴露于卡泊芬净的真菌细胞的蛋白成分变化实现，极大地缩短了检验结果回报时间。

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