急性心肌梗塞的新生物标志物微小核糖核酸（MicroRNA）是否是瓶颈中的新宠儿 ...

司徒凌楚

       急性心肌梗死（AMI）的早期发现对决定保护治疗并防止心肌组织进一步损害是至关重要的。美国心脏病学会的指导方针给出的AMI标准是肌钙蛋白增加或减少至少＞99%的健康人群值（不精密度CV＜10%）伴随着缺血的症状或MI基于影像或心电图形式的证据。在过去的几年中，肌酸激酶CK-MB测试已被新一代肌钙蛋白试验取代。现在高灵敏度Tn试验被视为心肌梗死的金标准。的确，高灵敏度肌钙蛋白试验提高的分析灵敏度已经降低了心肌损伤阈值，使皮克/毫升范围的基线值更容易被检测，从而加快了早期诊断。然而诊断的敏感性的增加牺牲了诊断特异性。一个主要的挑战是，在更大比例的健康人中高灵敏度试验定量肌钙蛋白。这些试验还检测与其他病理生理情况如原发性心肌病、心肌炎、肾功能衰竭、充血性心力衰竭和肺栓塞相关的心肌细胞死亡，未区分组织损伤的机制，从而限制了基于MI严重性（例如，ST段抬高心肌梗死（STEMI）对非STEMI）的区分能力。所以，将高灵敏度肌钙蛋白分析引入到临床实践已经引起治疗急性胸痛患者的医生的困惑。因此，可迅速可靠地划入或排除AMI的理想生物标志物依然缺乏。

       在过去的几年里， 对循环微小核糖核酸（miRNA）作为潜在的AMI的新生物标志物的兴趣蓬勃发展。miRNA是一类位于具有通过基因沉默抑制蛋白质合成功能的蛋白编码基因的内含子中的单链的，非编码小核糖核酸（约22个核苷酸长度）。最近的动物和临床研究已经证明，冠状动脉事件后不久血浆中miRNA增加。最近激增的临床数据证明，循环miRNA不仅在诊断也在预测生存的结果和动脉粥样硬化的负担中具有实用性。某些miRNA亚型专门出现在AMI后的循环中，似乎显示比高灵敏度Tn试验检测到的肌钙蛋白更快的动力学释放。此外，从临床敏感性和特异性来说，miRNA循环测试似乎与高灵敏度的肌钙蛋白检测的好处匹配。在某些情况下，当与心脏生物标记物一起使用或作为一个独立的测试时，miRNA测试提高了诊断潜力。此外，一些研究小组确定了可准确区分非STEMI和STEMI患者的循环miRNA的独特的标签模式——一个对急性病治疗的早期的管理机构有重要意义的诊断。

       在本文中，对冠状动脉疾病有兴趣的miRNA专家阐明循环miRNA在AMI测试中的实用性，并深入了解这个潜在的强有力新工具的好处、应用、挑战和局限性。

一、你是否认为依然缺乏快速可靠的AMI诊断的理想生物标记物？现在使用的当前的MI测试方法的挑战是什么？

       Katey Rayner（渥太华大学心脏研究所、心血管代谢MicroRNA和表观遗传学实验室副教授）:快速和准确的测试AMI的临床必要性是显而易见的，并且当前使用肌钙蛋白（和其他基于心肌酶的检测）确信可预测AMI的存在。与此相反的是，缺乏对稳定的冠状动脉疾病，以及更重要的不稳定的冠状动脉疾病的迅速有效测试手段。我的观点是，尽管miRNA可能和心肌酶的值有强烈关联，甚至可能预示AMI的发生，这些基于miRNA的检测将只是巩固诊断，不一定会显露任何新的信息。另一方面，迫切需要识别血管破裂风险中的不稳定斑块的标记物，而miRNA可提供这个工具。

       Stephanie Dimmeler（德国法兰克福分子医学中心血管再生研究所教授）：早期和敏感的检测AMI的可靠的生物标记物已经有了（高灵敏度的肌钙蛋白试验），我不会期待循环miRNA对常规做法会更好。也许miRNA的释放早于肌钙蛋白（这将允许我们更早地检测出AMI）；然而，这种情况尚未明确。

       George A. Calin（德克萨斯大学安德森癌症中心医务部实验疗法部门教授）:对于MI的许多标记物，缺乏诊断的特异性是一个方面。另一方面，一些miRNA有组织特异性表达（例如，miR-133家族），因此，高度期望确定出更特异的标志物用做心肌坏死的早期标志物。而且，如果和miRNA无关的高特异性的新标志物被确定出来，可以预期这个标记物与miRNA组合使用来预测MI。

       Thomas Thum（汉诺威医学院教授）：一般说，我认为很难击败当前检测心肌梗死的方法的敏感性和特异性，特别是就来自高灵敏度肌钙蛋白试验的应用来说。然而，有的情况下新生物标志物将会非常有用，例如对检测伴随心肌损伤的其他的心脏病（和传统生物标志物疾病的兴起）例如应激性心肌病或各种形式的心肌炎。

二、为什么在进入临床环境的替补席上转化miRNA研究中对心血管群体有激增兴趣?

       Katey Rayner：围绕基于使用miRNA-治疗心血管疾病的方法的兴奋在一定程度上是由于抗-miRNA靶位策略的相对快速发展。miRNA被发现不到5年后，在哺乳动物中，“antagomirs”被成功用于非人灵长类动物抑制miR-122，降低总血浆胆固醇浓度，这促进了抗-miR122抗体快速进入临床试验。人们几乎可以争辩，对miRNA的生物学的理解已经落后于抑制剂技术的发展，但是这帮助了大量的实验室验证特定的miRNA在心血管疾病中的作用，并支持他们对临床试验的考虑。与有时以基因/分子为靶标的方法（即小分子，药理作用）不同，基于miRNA的疗法有通过同时微调多个基因调节整个通路的，经常导致更持久的持续的效果潜力。

       Stephanie Dimmeler：miRNA能改变基因的表达网络，并且在患病期间经常受到深入调节。而且，可得到病理上的以miRNA为靶标的小的抑制子，使得治疗策略的测试更容易。总之，miRNA抑制子已经被安全用于最近的II期临床研究（对肝炎的研究）；因此，我们可期望miRNA抑制子也可用于心血管疾病的治疗。

       George A. Calin：miRNA参与任何类型的至今被研究过的任何一个生物过程，以及被分析的任何类型的疾病。因此，大量的努力和基金持续投入到基于miRNA识别的的新治疗手段，和其他新的标志物一样，回答许多尚未解决的临床问题，例如对治疗的反应的预测。最近出版的采用miravirsen（抗miRNA-122，一种高度特异的肝miRNA的抗体）在慢性丙型肝炎病毒基因型I型感染患者的二期临床试验显示，存在长期剂量依赖丙型肝炎RNA水平的减少，没有病毒的抵抗证据，这当然增加了开发新治疗法的希望。

       Thomas Thum：在新颖的诊断和治疗平移的方法开发中看到过激增的兴趣。事实上，miRNA靶标常常按照功能分组，因而是非常有吸引力的治疗靶标，并且最近许多动物疾病模型的研究显示miRNA疗法巨大的潜力。的确，在很短的时间内我们将看到在人类测试miRNA的治疗的临床研究。

三、miRNA以许多不同的方式到来。假设发现不同形式的循环miRNA反映心肌损伤，什么样的严谨标准应当用于确定其作为生物标志物的实用性，以及你认为哪个miRNA符合这些标准？

       Katey Rayner：作为其他病理的结果，在血浆/胞外空间没有找到miRNA被认为是心肌梗死（MI）生物标志物最重要的标准。也就是说在其他并发症如肝脏疾病、肾脏功能障碍，或糖尿病的患者不能检测到用于诊断心肌衰弱事件的miRNA。尤其重要，假设许多冠状动脉疾病患者患有多种并发症，基于miRNA的诊断测试将会非常复杂。目前，miR-1/133和miR-208b开创了基于准确性和灵敏度的用于区分AMI患者和健康对照组的道路，然而这需要有更大的队列人群进一步确认。

       Stephanie Dimmeler：下最后结论还为时过早。我们当前的测量和规范化方案离理想甚远，方法学的改善可能对确定miRNA作为标志物非常有用。定义该实用性的标准和其他生物标志物没有太大的区别，只是简单地需要在规模临床队列中进行大量的测试（和确认结果）。

       George A. Calin：因为循环miRNA作为激素发挥作用，这是从它们在正常人群中的表达，变化产生的一个重要实际结果。受到不同的“外在”因素，如环境温度和压力影响，在人群中按照年龄、性别和生理事件（月经初潮或怀孕） 循环miRNA “正常”的浓度相差很大。这一观点在事实上的实际效果是，对于任何比较miRNA在从正常的个体到癌症患者的任何类型的体液中表达的研究，要以至少在年龄、性别、和种族“配对”的方式设计研究和使用至少两倍对照的患者至关重要。通过这种方式，可以评估和比较正常人群充分的表达变化，在独立队列与疾病组（本示例是AMI）的比较则更有意义的和更具可重复性。作为标志物的最好miRNA应用之一是在心肌组织的唯一表达；新一代测序（NGS）表达谱可帮助识别这样的miRNA。

      Thomas Thum：第一个重要的问题是结果的标准化。目前还没有真正规范化的金标准， 因为没有“稳定循环”的miRNA。许数研究人员通过加入质控miRNA使之标准化。我不认为一个单独的miRNA比传统的MI生物标志物有更好表达。然而，miRNA标志物的组合，如心肌细胞损伤、炎症和内皮细胞和成纤维细胞改变的特异miRNA可以告诉我们一些潜在的造成心肌梗死的因素，并影响到治疗方案的改变。

四、在文献中有一些争议，在生理条件和病理刺激反应中什么机制决定了循环miRNA的水平。你能说明一下这个争议，并解释我们已经知道的它的生物学功能它们是心肌损伤介质，或者它们是自身损伤后被释放的？

       Katey Rayner：有许多关于从外来体或微囊活性分泌并与对某种刺激发生反应的蛋白复合体有关的miRNA。凋亡小体也包含miRNA，尽管尚不清楚这些miRNA是特异或是非特异地被包裹进这些小体。很有可能，miRNA充当与邻近或遥远的细胞以旁分泌的方式进行通信的信使，尽管确切的机制有待阐明。在心肌梗死事件中，miRNA很有可能作为一个来自心肌损伤受损组织的被释放的信号，也许是指导祖和/或炎症细胞导向损伤位置。这样的miRNA用作生物标记物的话其过程是特异的或非特异的无关紧要。最重要的是它们对MI诊断的预测价值。机理上，如果某些miRNA改变对损伤的反应，则可受操控的用于从使用miRNA抑制获益的治疗或替代疗法。

       Stephanie Dimmeler：一般来说，miRNA能通过不同的共存机制被释放，但一些miRNA通过优选通路被输出。基于我们的研究，我们得出这样的结论，囊泡包裹的miRNA是大多数miRNA的主要存在形式。然而，我们也可以检测到与蛋白质（如argonaute 2（Ago2））结合的miRNA和与脂蛋白结合的miRNA，尽管很少。在活的有机体内不清楚也很难进行生理远程通讯功能的研究。当然在培养细胞中，各种组织证明细胞外miRNA的转移和生物活性；然而，是否低浓度的细胞外miRNA能引起体内的生物功能仍是一个开放的问题。

       George A. Calin：将循环miRNA当做激素有两方面有待讨论。一个讨论是分泌步骤，几种机制的结果，包括外来体，微囊，或凋亡小体内miRNA存在以及与Ago2蛋白质和高密度脂蛋白（HDL）复合物的相互作用。所有这些形式使体液的miRNA更稳定，因此更容易被定量。第二个是问题，对效应细胞的影响是什么？这些影响是“经典”行动机制的结果，这意味着通过序列互补靶向信使核糖核酸（mRNA），其次是mRNA降解和/或转译的封闭，导致蛋白表达减少。最近一个新的出乎意料的作用机制被确定，miRNA作为Toll样受体在癌症细胞和阿尔茨海默病的直接受体激动剂。这样的机制非常可能还存在于各种心肌疾病患者内。

       Thomas Thum：许多miRNA已经结合在稳定的Ago2复合物上并在细胞膜破裂后以这种稳定的形式被释放，例如一个缺血性的损害。此外，也可以分泌活性miRNA，如，通过凋亡体或小外来体。这些循环miRNA被吸收到其他靶细胞和发挥生理功能（如激素），因此有旁分泌活性。这是很吸引人的，但需要许多详细机制的后续研究。

五、作为MI的新型生物标志物，你怎么看待miRNA应作为急性和慢性疾病患者管理的诊断工具？你如何看待miRNA符合或者弥补当前诊断范例如肌钙蛋白的漏洞？

       Katey Rayner：大多数循环miRNA与肌钙蛋白浓度在AMI患者中紧密关联。有证据表明，血浆中miR-208 b可能早于肌钙蛋白T出现，尽管这一点还有待证实。如果某些特定miRNA出现早于心肌酶的出现，那么使用这些miRNA是很有力的。正如以上所描述的，这些循环miRNA标志物的真正潜力在于它们在MI发生前检测/诊断稳定或不稳定冠状动脉疾病发生的能力。这是目前临床实践缺乏的。

       George A. Calin：一个关于在任何类型的急性或慢性疾病，包括心脏疾病的血浆中定量miRNA的重要性的方面还很不完善，主要是以下内容：miRNA作为激素的浓度，每个个体是特定的，我们带着特异的表达模式出生。因此，血浆miRNA浓度的测量代表着预测对治疗的反应的简单而容易的方法，因为这有独特个体遗传的成分。

       Thomas Thum：我认为miRNA诊断的一个巨大的利益，主要在慢性疾病。集中在心脏，我认为将会有miRNA用于诊断各种形式的心脏衰竭的特定的模式以及潜在的根本原因。该循环miRNA的模式也告诉我们诸如心衰之类的慢性病例如心肌纤维化进展的持续病理学事件。此外，已经有研究显示循环miRNA的预后能力。在未来，我们将从更大的患者队列看到结果，将真正回答miRNA在心血管疾病的临床使用这个问题。

六、研究表明，AMI患者血浆中有些miRNA明显和特定的升高。升高的miRNA浓度是否应该得到临床环境的定量或定性解释？为什么?上述在正常和患病群的截止上限或参考区间结果的解释是有用的吗?

        Katey Rayner：最终，在一个大的人群中确定任何miRNA在作为MI的生物标志物使用前需要经验确定“正常”浓度的范围。这应该是通过标准化程序来完成，并通过很多中心使用和验证，理想的形式是“床边”测试。这些重要步骤完成之前，预测基于miRNA浓度去考虑正常/非正常的表达是不可能的。此外，心脏特异的miRNA（比如miR- 208）将会是是理想的，前提是血浆中miRNA的存在和减少已经被明确知道它的结果的任何不确定性是否是其他一些组织损伤/病理造成的。

       Stephanie Dimmeler：对常规临床使用而言，我们需要有明确的截断值和可以接受的对日常的结果变化的可靠测量。在目前的技术条件下，测量现有的队列人群的标本是可行的，但标准化问题尚未解决。基于PCR的测量技术使用重组miRNA定量miRNA浓度或添加同位素示踪剂的miRNA标准化对于允许床旁检测循环miRNA是不够的。

       George A. Calin：应该定量解释浓度，而且应该使用正常和疾病人群的参考区间。通过定量反向转录PCR，一个非常敏感的性能分析方法，miRNA也将在特定条件下以正常量出现（例如，经过繁重训练的运动员会有“假AMI”的血浆中miRNA，浓度是多少?）。

       Thomas Thum：如果这些miRNA用于临床医疗，则非常需要确定参考极限，假定基于PCR的检测系统的使用，这需要付出很大的努力。不同实验室之间的结果可比性也将会相当困难。然而，这可能是半定量的方法。不仅在健康人群组，而且在患病的个体，参考区间也是必要的。

       七、目前用于测量miRNA的一些先进的技术是什么?主要的分析挑战或局限性是什么？为了可靠测量急性和非急性临床环境的miRNA需要什么样的技术改进？你认为床边检测（POC）现实吗?

       Katey Rayner：目前，最快速测量miRNA的方法是定量PCR。一个不断发展的测量遗传物质（包括miRNA ） 的诊断平台是Nanostring，尽管目前周转时间是24小时，这对于诊断MI并不理想，只适合于慢性疾病的诊断。最近，床边诊断的“快速基因”测试片在检测个体的CYP2C19等位基因型的应用（指导冠状动脉介入期间抗血小板治疗）告诉我们，一个测量miRNA浓度的快速床边测试是非常可能实现的。事实上，用于基因分型和miRNA检测的技术没有什么太大的区别，实现床边检测可能比你想象的更快。

       Stephanie Dimmeler：还没有。目前，大多数实验室利用基于PCR的技术，但也使用其他技术。PCR很敏感但很难标准化；其他技术可能具有更好的重复性和易于标准化；然而，敏感性不够。这个技术领域目前处于早期，确信这个技术需要（当然一定会）进一步发展。

       George A. Calin：因为特异性好，易于操作，重复性好，成本低，最常用于基于化学发光（CLIA）的实验室的转化医学的技术是定量反转录PCR。局限性是难以找到有用的标准品用于并行独立样品组的测量。一个替代方案是用加入同位素示踪剂的非人源的miRNA，并假定其具有与样本一致的质量，但在大多数实例中情况不是这样的。另一个替代选择-成本高，但更强大-是小RNA测序，可识别以前从未报导过的新miRNA。

       Thomas Thum：最实用技术是实时的miRNA检测。其他技术包括芯片检测和磁珠技术，用于荧光激活的细胞分选。我认为床边检测可能发展起来（2小时时间），但是如前所述，我认为miRNA将更多地进入慢性疾病的诊断。

八、沿着现在的道路向前走，你认为检测用于AMI的循环miRNA能成为现实么？如果不能，在我们的理解的范围内需要克服的mRNA测试的主要障碍是什么？

       Katey Rayner：为了使循环miRNA成为一种广泛使用的诊断AMI的测试，该测试需要比今天使用的测试更快更好（也许更低廉）。在这方面，一个单独的miRNA测试将可能不会比肌钙蛋白测量更有价值，然而，一组多个miRNA可能会增加心脏标记物测量的信心，甚至可能更早地检测出来。相比之下，如果可以识别预测不稳定冠状动脉疾病的一个miRNA或一组miRNA被检测出来，这对指导临床治疗将极有价值。为了让这样的场景成为现实，需要通过标准化的和商业可用的方法按照以往的经验确定每个循环miRNA的“正常”值范
围。理想情况下，这可以通过床边测试做检测，不到1小时可提供快速、准确的结果。如果符合这些条件，在临床上诊断急性和慢性冠状动脉疾病，循环miRNA将会有巨大的影响，可能产生针对失调miRNA的新疗法。

       Stephanie Dimmeler：用于AMI不太可能，但可能用于其他适应症。主要障碍是建立一个快速和灵敏的，但稳定性好并且标准化，可以在日常使用的方法。此外，我们必须测试和识别可能会影响测量的干扰因素。

       George A. Calin：随着测序技术向临床实践的深入发展，在未来几年将确定更多的miRNA，所以很可能，在接下来的5年，miRNA将被发现为急性和稳定的疾病预后的预测因子，一个重要的主题是慢性疾病的预测，在接下来的5年miRNA可以在现实应用。

摘自定向点金《临床实验室》杂志2014年第七期