艾滋病毒检测的发展

真诚永远

       Sue Kehl博士从威斯康星大学密尔沃基分校获得奖学金，自1992年加入威斯康星医学院。她是威斯康星医学院副教授，威斯康星州儿童医院临床微生物学实验室技术指导，在2013年AACC年会上谈到了如何处理疾控中心提出的艾滋病毒（HIV）算法以及给出了如何适应这些算法的建议。本文讨论了HIV检测的历史和发展，没有讨论用于未标志用途或研究用途的检测。

一、艾滋病

       艾滋病（AIDS）最初于20世纪80年代被识别。1983年，Microsoft Word问世，麦当劳引进鸡丁汉堡，Tom Brokaw成为美国国家广播公司（NBC）的知名主持人等。也是在这一年，在美国和法国同时发现了艾滋病毒。经过一番辩论后，其被命名为人类免疫缺陷病毒（即艾滋病毒HIV）。截止到1986年，据报道有26000例艾滋病，其死亡率为56%。该疾病是由我们现在称之为HIV的病毒引起的。它是一种慢病毒，属于人类逆转录病毒家族。包括两种类型，HIV-1和HIV-2，具有RNA基因组，被病毒衣壳包围，有些许包膜。这些结构对于讨论HIV检测很重要。图1表示未经治疗的进行性HIV的病程。我们可以看到在急性期病毒存在于体循环中，然后体内生成相应抗体。在未经治疗的艾滋病中，患者最后到达第3阶段，导致所谓的获得性免疫缺乏综合症（AIDS）。在这个阶段，抗体下降而病毒再生。

       艾滋病病程分为3个阶段。第1阶段是指原发性HIV感染，潜伏期为1-3周。患者可能无症状或者出现以下任何或所有症状：单核细胞增多样症状（也就是心神不安、咽炎、低烧、颈部淋巴结病），各种系统损害比如肌痛、关节痛等，甚至是脑炎皮疹（小的粉红色斑块或斑点，分布于机体大部分地方）。患者感染艾滋病毒后2-3个月产生抗体。

       第2阶段可以持续很长时间，长达6年。抗体在这段期间产生。HIV可以在血液、精液和宫颈分泌物中检测到。通常情况下患者没有症状或者出现没有显著特点的淋巴结病或艾滋病相关复合症（ARC），症状表现为发烧、疲劳、腹泻、体重下降等。

       第3阶段由于CD4+T细胞下降，出现机会性感染和肿瘤症状。

       图2显示我们何时可以在急性感染期看到HIV病毒，抗体何时产生，包括抗包膜抗体和抗核抗体。橘色曲线表示何时可以在疾病发展过程中检测到RNA，咖啡色曲线表示何时可以检测到p24抗原，p24抗原是我们可以从HIV病毒中检测到的表面抗原之一。患者经历急性期，无症状期和艾滋病期。本文将关注的重点在于图上的空窗期。我们为什么在乎空窗期呢？在空窗期患者体内具有高水平循环HIV，具有高度传染性，而且通常没有症状。

二、HIV ELISA

（一）第一代酶免疫测定（EIA）
       1985年，CD被首次引进，泰坦尼克号的位置被确定，第一通手机电话打出，保险公司开始筛查艾滋病。1985年3月第一代酶免疫测定问世，采用从H-9细胞培养获得的完全破裂HIV抗原。开发该试验实际上
是为了筛查输血用血液，不是为了诊断感染患者。该试验检测HIV-1的IgG抗体，检测占主导地位的M亚型，但是检测其他亚型的效果不好，也不能检测HIV-2。制造商声称灵敏度为98.3%-100%，特异性为99.2%-100%。但是我们必须了解真正的灵敏度是未知的，因为我们根本没有好的诊断方法。最早可在患者感染60天后检测到抗体。

       由于这类灵敏度和特异性要求，我们需要确认测试。因此为输血人群开发了这样的测试，这类人群的HIV流行率是0.2%-0.3%。该群体的阳性预测值是36%，所以三分之一的阳性值也就是EIA检测得出的阳性值是真阳性。

1. 确认测试：蛋白质印迹法（western blot）
       蛋白质印迹法识别特定病毒蛋白的抗体，主要包括核心蛋白p24、外包膜蛋白gp160/120和包膜跨膜蛋白gp41这3种病毒基因组的抗体。该方法比EIA更灵敏和更具特异性，但是使用蛋白质印迹法的最大问题是不确定性。早期血清转换患者通常不对这3种病毒基因组产生抗体，还有交叉反应性抗体患者的蛋白质印迹结果也是不确定。此外，该试验在技术上有难度。

       有一个蛋白质印迹法经过FDA批准，大多数其他检测都是内部开发的检测，即实验室自己培养病毒、进行进行批量处理。执行操作和检测的人员的技巧和经验各不相同。谱带强度（band intensity）具有变异性。此外，试验缺乏特异性，HLA抗原结合在相同部位，具有HLA（人类白细胞抗原）抗体的患者看似也有HIV抗体。

       这个试验最初被FDA批准时，我所在的实验室与美国军队签订了合同。我每天必须读取50-100例蛋白质印迹，对于我来说就像个噩梦，我再也不想经历第二次。因为谱带强度变异太大。即使他们使用的是FDA批准的检测，但是如果我看过这么好的谱带，我应该会像到了天堂那么幸福。

2. 确认测试：IFA
       1992比尔·克林顿成为总统，洛杉矶暴乱，Microsoft Windows发布了3.1版本，AT&T发布了价值1500美元的视频电话等。1992年FDA批准了IFA检测来确认抗体特异性。IFA（免疫荧光测定）采用表面具有HIV-1抗原的无限增殖人类T细胞。该检测预期用作附加的、特异性更强的试验，是重复反应性EIA试验。比EIA更快，不确定结果更少，因为我们不会挑选具有交叉反应性抗体的患者和早期感染患者。检测灵敏度还可以，99.7%-100%，但是请记住我们没有真正的金标准。

（二）第二代EIA
       第二代EIA采用p24和p41的重组蛋白，排除了因II类HLA抗体与用于培养病毒的细胞底物发生的非特异性反应，使特异性提高到99.8%-99.9%，也提高了本来就很高的灵敏度，使检测到抗体的窗口期从感染后60天减少到45天。

（三）第三代EIA
       第三代EIA既检测Ig G又检测IgM，不止采用M亚型的重组蛋白（p24、p41、gp120和gp160组合）还有O亚型（合成肽）以及HIV-2（gp36），而其他检测都只关注M亚型。据报道其灵敏度为100%，特异性为94.8%-100%，依据制造商而定。更重要的是，窗口期大幅下降，从45天缩短到22天。

（四）P24抗原检测
       大多数情况下，p24检测用于检测培养中生长的HIV，事实上用于培养上清液检测，也用于检测血清、脑脊髓液（CSF）和新生儿筛查。这是第一个用于新生儿筛查的检测。有些检测采用免疫复合物分离步骤来增加灵敏度，用中和步骤来增加特异性。市场上可以买到两种检测，一种来自雅培（Abbott），一种来自库尔特（Coulter）。

（五）第四代EIA
       第四代EIA可检测HIV-1/HIV-2抗体，包括O亚型，以及HIV p24抗原，但是不能区分它们。所以即使结果为阳性，我们也不能分辨出到底是p24抗原还是HIV抗体。甚至在低风险人群中，该检测的灵敏度（100%）和特异性（99.8%）也非常好。该检测适用于常规检测和围产期检测，不能用于筛查供体的血液或血浆。有两个检测经过FDA批准：2010年获得批准的雅培Architect检测；伯乐（BioRad）GS HIV Ag/Ab Combo EIA。这些检测使窗口期从22天缩短到17天。有些时候在抗原水平低于可检测水平而且抗体水平也没有上升到可检测水平以上时我们会看到免疫复合物形成，这可能是潜在的第二个“窗口”。

1. 雅培Architect HIV Ag/Ab Combo
       在基于693例个性化HIV阳性样品中，该检测针对HIV 1/2 Ab的灵敏度是100%。该检测对HIV p24 Ag的分析灵敏度是18.39pg/mL，基于63例HIV p24 Ag样品的临床灵敏度是100%。检测特异性非常高，99.77%
（6113/6127），即使人群感染HIV的风险较低。对孕妇的检测特异性
是100%（448/448）。

       另一项研究采用从疾控中心（CDC）获得的特点明确的标本。在3386例HIV感染患者中，灵敏度是99.94%（95%置信区间[CI]：99.79%-99.99%）。在7551例未感染HIV患者中，反应特异性是98.78%（95%CI：98.5%-99.01%）。执行一式两份测试，当前算法指出所有阳性试验应该显示重复反应性，特异性提高到99.5%（95% CI：99.31%-99.64%）。在58例急性HIV感染患者中，检测灵敏度为83%。所以仍有某些人实际上感染了HIV但是这些试验未能检测出来。

2. GS HIV Ag/Ab Combo EIA
       伯乐将检测灵敏度细分为HIV-1 100%（95% CI：99.7%-100%），HIV-2 100%（95% CI：98.1%-100%）。据报道该检测对HIV p24 Ag的分析灵敏度是0.65IU/ml，具有非常高的特异性，99.9%（95% CI：99.8%-99.9%）。

       执行多中心研究来评估GS HIV Ag/Ab Combo EIA，结果显示，在1603例HIV感染患者中，灵敏度为100%；在将近6000（5989）例低风险人群中，特异性为99.9%；在将近1000例高风险人群中，特异性良好（99.9%）；该试验还有儿科人群的数据，特异性100%，但没有获得有关雅培检测的儿科数据；在65例急性HIV感染患者中，灵敏度接近90%（89.2%）。因此，该试验也有窗口。通过HIV p24和抗体试验，我们发现窗口期已从22天下降到10-15天。

三、快速试验

       2003年美国入侵伊拉克，苹果公司发布了iTunes……首批快速试验也于2003年获得批准。让我们更详细地看一下这些快速试验。

       Reveal G3 Rapid HIV-1，是最早批准的HIV抗原试验之一，其制造商是MedMira，只检测HIV-1。检测灵敏G3 Rapid HIV-1，是最早批准的HIV抗原试验之一，其制造商是MedMira，只检测HIV-1。检测灵敏度非常高，99.8%（95% CI：99.2%-100%）。它是适度复杂的试验，因为检测血清和血浆，不检测全血。大部分全血检测都是CLIA批准的。血清和血浆特异性具有差异，血清99.1%（95% CI：98.9%-99.4%），血浆98.6%（95% CI：98.4%-98.8%），特异性不如其他试验好。

       Clearview  STAT-PAK  和Complete HIV 1/2，这两个试验都检测HIV-1和HIV-2，但是不能进行区分。都具有CLIA豁免的全血检测，适度复杂的血清和血浆检测。都采用胶体金共轭抗体。STAT-PAK试验的包装说明书具有局限性，13年内未经过评估。

       OraQuick ADVANCE  HIV 1/2，由OrasureTechnologies制造，可检测HIV-1和HIV-2，是唯一批准用于检测口腔标本的试验。全血和口腔标本试验都是CLIA豁免的试验。该试验的包装说明书也有局限性，12年内未经过评估。

       Uni-goldTM Recombigen HIV-1/2，像其他试验一样，可检测HIV-1和HIV-2，具有CLIA豁免的全血检测以及适度复杂的血清和血浆检。如表1所示，大部分快速试验的灵敏度和特异性都非常好，都是CLIA豁免和适度复杂的检测。

       MultiSpot HIV1-HIV2，由伯乐制造，采用多个蛋白质斑点，对照斑点、HIV gp36包膜糖蛋白斑点、重组gp41斑点和HIV gp41多肽斑点。这是唯一可以区分HIV1与HIV2的试验。该试验只检测血清和血浆，是适度复杂的检测，灵敏度和特异性非常高。

       首批实时定量HIV试验于2010年获得批准。2010年，英国石油公司（BP）海湾石油泄漏事件，ObamaCare“病人保护和支付得起的医疗法”被批准。如表2所示，雅培试验是实时PCR，在m2000系统上运行检测，以整合酶基因的单个区域为靶标。Cobas试验试图避免可能与治疗导致的突变有关的基因，采用两种不同基因区的联合扩增。VERSANT HIV-1 RNA试验是一种分支链DNA信号放大技术（bDNA）检测。NucliSENS EasyQ 试验是一种核酸序列依赖性扩增（NASBA）检测。这些检测的分析范围没有显著差异。所有这些试验经FDA批准仅用于评估患者进展，没有一个试验可以确认反应性EIA。只有一个FDA批准的试验可确认反应性EIA，是一个定性HIV检测。

       当前测试算法的问题在于这些筛查试验的灵敏度和特异性，不管是使用第三代EIA检测还是第四代EIA检测，都要超越蛋白质印迹法确认测试的灵敏度和特异性。这就意味着蛋白质印迹法现在可能无法证实真正感染的标本。

       从不同的方式来看，我们从能够检测出蛋白质印迹法是真正阳性的时候开始，而且可以看到在蛋白质印迹法得出阳性结果之前25天以上，我们就有试验可以检测到患者存在HIV。因此，也突出了我们对新算法的需求。

                                                                                    摘自定向点金《临床实验室》杂志2014年第六期
                                                                                                             编译：王小茜