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河东狮

丙型肝炎病毒（HCV）感染的临床检测指标主要分为血清学检测和病毒核酸检测。抗-HCV是HCV感染的临床诊断、健康人群体检和血液筛查中的一个重要的血清学指标。抗-HCV阳性提示HCV现症或既往感染，但是不能鉴别HCV急性、慢性或既往感染。抗-HCV初筛检测目前在临床实验室基本上均采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和化学发光免疫分析方法，确认方法则为重组免疫印迹试验（RIBA）。病毒核酸检测包括HCV RNA检测和基因分型。HCV RNA阳性表示病毒存在于机体内，提示HCV现症感染，包括HCV急性或慢性感染的病毒活动性复制。HCV RNA基因分型结果主要帮助判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案。 在诊断HCV感染时，主要涉及的检测指标为抗-HCV和HCV RNA。为更好地理解抗-HCV和HCV RNA的检测及其对诊断的意义，首先需要了解HCV的基因结构和自然史。
一、HCV的基因结构：
      HCV为一有包膜呈球形的正单链RNA病毒。HCV基因组为单股正链RNA，全长约9 500 碱基。 基因组两侧分别为5’和3’非编码区，中间为开放读码框（ORF），分为结构区和非结构区(图1)。结构区包括核心蛋白区 (C) 和两个包膜蛋白区 (E1、E2)，分别编码核心蛋白和包膜蛋白。非结构蛋白区包括NS2、 NS3、 NS4和NS5区，编码功能蛋白，如蛋白酶 (NS2、 NS3和NS4A区)，螺旋酶 (NS3) 以及依赖RNA的RNA多聚酶(NS5B区)。虽然非结构蛋白不是病毒颗粒的组成部分，但在病毒复制中起到非常重要的作用。目前通常采用基因工程表达上述结构和非结构蛋白作为包被抗原，来建立抗-HCV检测的ELISA方法。HCV基因组具有显著的异质性，同一基因组不同区段变异程度有显著差别。5’非编码区最为保守，因此PCR检测HCV RNA的引物设计多选用该区域。
                       
二、HCV感染的自然史
      大部分患者在感染的急性期无明显症状，伴有高水平的病毒血症和ALT升高。HCV急性感染后HCV RNA早于抗-HCV出现于血液中。HCV RNA最早可于暴露后2周检出，HCV 核心抗原可在HCV RNA出现后1～2d检出，而抗-HCV直到8～12周才能检出，也就是说，在HCV感染发生后，有约8-12周的时间，仅能检出HCV RNA，而抗-HCV为阴性，即抗-HCV检测的“窗口期”，“窗口期”的长短与检测试剂有关（见表1）。抗-HCV不是保护性抗体，是HCV感染的标志。15%～40%的HCV急性感染者可在6个月内清除感染，在感染清除的过程中，有可能HCV RNA水平很低不能检出，仅抗-HCV阳性；而65%～80%的患者病毒持续6个月仍未被清除，称为慢性HCV感染。一旦慢性丙型肝炎发生，HCV RNA滴度开始稳定，自发痊愈的病例很少见。除非进行有效的抗病毒治疗，否则HCVRNA很少发生自发清除。在临床上，慢性丙型肝炎的患者抗-HCV多为阳性（免疫抑制的患者，如HIV感染者、实体器官移植受者、低丙种球蛋白血症或者血液透析患者可出现抗-HCV阴性），HCV RNA可为阳性也可为阴性（经抗病毒治疗，HCV RNA水平低）。
三、抗-HCV及检测方法
      抗-HCV ELISA和RIBA检测方法的建立的基础在于HCV结构和非结构蛋白或多肽抗原重组表达及体外合成的成功，并经历了第一代、第二代和第三代试剂的发展过程。图1显示了三代抗-HCV检测试剂所包含的抗原片段及其在HCV基因组上所对应的区域。研究表明，HCV的C、NS3、NS4和NS5四种蛋白，均能有效地诱导HCV感染者的抗体应答。目前，第三代抗-HCV ELISA检测试剂与前两代试剂相比，灵敏度有很大提高，窗口期也大为缩短（表1）。但是，使用ELISA方法进行检测，其抗-HCV阳性的价值与检测人群有关，在HCV感染率低的人群，常存在假阳性的问题。美国CDC的研究表明，在抗-HCV阳性率小于10%的各类人群（如志愿献血员、现役和退伍军人、普通人群等）中，使用经美国FDA批准的第二和第三代抗-HCV ELISA试剂检测，假阳性平均约35%（15%~60%）。造成假阳性的原因可能有：类风湿因子的干扰、高免疫球蛋白血症、标本中SOD的干扰、用于固相包被的HCV基因工程抗原不纯等。
                                   
      抗-HCV RIBA的检测是抗-HCV的初筛检测后的补充确认实验，其原理是将重组有上述四种HCV抗原直接分条固相在硝酸纤维膜上（图2），当加入血清（浆）标本后，如果标本含有针对这四种抗原的抗体，抗体即可与固相上的抗原结合，加入酶标的二抗，温育洗涤后，再加入底物显色。出现两种以上条带显色一个“+”以上，即为阳性；只有一个条带显色，为不确定；除质控带外，无条带显色，则为阴性。RIBA很高的检测特异性，还可以分析HCV不同片断的特异性抗体。
                       
      根据图3所示的美国CDC推荐的程序，由ELISA和免疫化学发光试验等初筛方法得到的阳性反应标本，可通过两种方式来决定下一步的确认及报告。一是直接采用RIBA或HCV RNA检测确认；或是根据初筛检测的S/CO比值来确定，S/CO比值高于一定值的，直接报告阳性，比值低的则采用RIBA进行确认。这样既可提高检测报告的可靠性，又可减少需要确认检测的标本数，从而大大节省检测费用。
                                       
四、HCV RNA检测
      HCV RNA检测可直观地反映病毒的存在，HCV RNA阳性即表示机体内存在HCV， 而且HCV RNA最早可于暴露后2周检出，而抗-HCV直到8～12周才能检出，因此可减少抗-HCV“窗口期”造成的漏检。HCV RNA检测分为定性和定量检测，以往认为HCV RNA定量检测的灵敏度低于HCVRNA定性检测，但是现在随着HCV RNA定量检测技术的进步，其灵敏度逐可达12IU/ml，甚至超过了以前的定性检测，可以说，HCV RNA定量检测已经逐渐替代了HCV RNA的定性检测。但是，应注意HCV RNA检测中的假阳性和假阴性，一次检测阴性并不能完全排除HCV感染，应重复检查。HCVRNA检测用于：①抗HCV阳性的患者；②抗HCV阴性，具有难以解释的转氨酶增高，怀疑有急性HCV感染；③抗HCV阴性免疫抑制的患者；④决定是否开始治疗，只有HCV RNA阳性的患者才考虑抗病毒治疗；⑤准备抗病毒治疗的患者，需要根据RNA定量的结果进行疗效判断和治疗方案的调整。
五、抗-HCV和HCV RNA检测的意义
      抗-HCV和HCV RNA检测结果可出现以下四种模式，需要进行认真分析以明确其诊断意义（见表2）。AASLD（the American Association for the Study of Liver Diseases）指南指出：
      1、HCV RNA及抗-HCV均为阳性并伴近期ALT升高存在以下三种可能：①结合近期高危暴露史，考虑是否为急性HCV感染；②慢性HCV感染急性加重；③合并其他病原体导致急性肝炎的慢性HCV感染。
      2、抗-HCV阳性而HCV RNA阴性提示：①HCV感染痊愈；②急性HCV感染后HCV RNA的清除期；③假阳性或假阴性结果；此时，建议4～6个月后再行HCV RNA检测以明确诊断。
      3、抗HCV阴性而HCV RNA阳性，提示为抗体产生之前的急性感染早期或免疫抑制患者慢性HCV感染，也有可能为HCV RNA假阳性结果，建议4～6个月后复查抗HCV和HCV RNA。
      4、患者ALT升高而抗HCV及HCV RNA均为阴性，考虑可除外急性或慢性丙型肝炎诊断。推荐4～6个月后复查抗-HCV。
      需要说明是，抗-HCV和HCV RNA不能用于确定疾病的严重性，也不能用于预测疾病的预后和进展。