血清肿瘤标志物的检验学研究及临床应用价值

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       恶性肿瘤是严重威胁人类健康的最主要疾病之一，由于缺少理想的早期诊断手段，临床上发现肿瘤时往往已是中期或晚期，而大多数恶性肿瘤仅在初期阶段行外科切除术方可获得治愈机会，因而恶性肿瘤患者的死亡率居高不下。早期发现、早期诊断、早期治疗是肿瘤诊治的基本对策，而肿瘤标志物常常是早期发现肿瘤的唯一线索。肿瘤标志物(tumor marker, TM)是指在恶性肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞的基因表达而合成分泌的或是由机体对肿瘤反应而异常产生和\或升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶(同工酶)、多胺及癌基因产物等，存在于病人的血液、体液、细胞或组织中。
       迄今为止，人类对恶性肿瘤的治疗技术仍未有根本性的突破，肿瘤发病率在全球范围内呈上升趋势，恶性肿瘤已成为仅次于心血管疾病的人类第二大死亡病因。肿瘤标志物在肿瘤的临床诊断和治疗中占有重要地位，通过对血液或体液中肿瘤标志物存在或含量的检测，不仅可用于肿瘤普查、早期诊断、辅助诊断、良恶性鉴别和临床分期，同时对监测疗效、判断预后、预测肿瘤的复发和转移也具有重要价值。临床上为避免单一肿瘤标志物在检测中的阳性率不高、特异性不强等问题，常采用多种肿瘤标志物联合检测，应用多变量分析的方法来提高肿瘤诊断的阳性率和特异性。目前常用的血清肿瘤标志物检测方法包括放射免疫测定(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)、化学发光免疫测定(CLIA)、时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)等，这些方法存在一个共同的局限性——每次仅能检测一种肿瘤标志物，因此检测多项指标时不仅将增加被检测者的经济负担，也使检测者耗费更多时间、精力和试剂。
       液态芯片，也称为流式荧光技术，是基于美国Luminex公司xMAP(Flexible Multi-Analyte Profiling)技术的新型生物芯片技术平台，它是在可偶联探针的不同荧光编码微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应，通过红、绿两束激光分别检测微球编码和荧光信号来达到定性和定量的目的，一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应，是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子诊断技术平台。与常规免疫分析方法相比，液相芯片技术除了具有快速、灵敏、灵活、检测范围广等显著特点，其最突出优势还在于仅需少量样本即可同时对同一样本中多种不同的目的分子进行定性和定量分析，即具有高通量复合能力。目前，全球已有上千种基于xMAP技术的检测指标用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域，使该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具。
       肿瘤标志物的研究已有100多年的历史，随着分子生物学和人类基因组计划的进展，已被发现的特异性较强、灵敏度较高、有一定临床价值的肿瘤标志物已达100多种，为肿瘤的早期诊断提供了一个新的途径，目前已经广泛地应用于临床，而且越来越表现出其重要性，主要可应用于以下几个方面：
       1. 肿瘤普查及早期筛查。甲胎蛋白普查在我国是筛选和诊断无临床症状小肝癌的最主要方法，在非洲和东南亚国家也常被用作在乙型肝炎患者中筛查肝细胞性肝癌的工具。另外，将绒毛膜促性腺激素(HCG)用于一般人群绒毛膜癌的筛查，已使全世界的绒毛膜癌患者死亡率明显下降。
       2. 肿瘤的辅助诊断和鉴别诊断。如前列腺酸性磷酸酶(PAP)可用于前列腺癌的诊断以及判断转移癌是否来自前列腺。
       3. 肿瘤生物特点和疾病阶段的判断。测定肿瘤标志物的基础水平可为估计预后提供帮助。
       4. 肿瘤分类、分期和定位。如用CEA和NSE可区分胃肠道肿瘤是腺癌(CEA阳性，NSE阴性)还是类癌(CEA阴性，NSE阳性)；检测血清PAP水平可用于前列腺癌的辅助诊断和分期，这是因为晚期患者血清PAP明显高于早期患者；利用放射性核素标记的抗体与肿瘤抗原结合，可通过扫描来定位肿瘤。
       5. 疗效观察，判断预后，监测早期复发和转移。这是肿瘤标志物最有价值的作用。患者经治疗后肿瘤标志物的升降与患者的疗效和预后有良好的相关性。
       由于大部分单个肿瘤标志物敏感性或特异性偏低(一种肿瘤可产生一种或多种肿瘤标志物，而不同肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型既可有共同的肿瘤标志物，也可有不同的肿瘤标志物)，而且在不同的肿瘤患者体内，肿瘤标志物的质和量变化也较大。因此，单独检测一种肿瘤标志物，可能会因为测定方法的灵敏度不够而出现假阴性，一般提倡联合检测多种肿瘤标志物以提高检出的阳性率和特异性。其基本原则是合理选择不同性质、灵敏度、特异性能互补的、相对敏感的多个标志物组成标志群，进行联合检测，提高肿瘤标志物的应用价值。
       目前，已有很多研究机构将液态芯片技术的高通量优势与联合检测肿瘤标志物的临床需要结合起来，根据双抗体夹心免疫分析原理研制了能够同时检测人血清中CEA、AFP、f-PSA、t-PSA、NSE、CA242、SCCA、CYFRA21-1、CA724、freeb-HCG、CA125、CA19-9、CA153、CA50、HE4、pepsinogen I、pepsinogen II、ProGRP等多项肿瘤标志物的液态芯片试剂，其中众多指标已获得国家药监局批文并应用于临床检测。经研究发现，血清肿瘤标志物在液态芯片平台上的检测范围、最低检测限、精密度等指标与化学发光免疫分析法的血清检测结果相比具有良好的一致性，从而为开发用于健康体查、高危人群筛选以及临床检测的多肿瘤标志物液态芯片诊断试剂奠定了坚实的基础。
目前，常用的肿瘤标志物检测组合有：                     

采用液态芯片技术检测肿瘤标志物具有以下特点：
1. 高通量
       液态芯片试剂可在同一反应孔中完成多项指标的检测，克服了传统免疫检测方法一次只能检测一项指标的缺点，实现了高通量、多样本的快速检测。实现多指标联合检测最重要的前提是各种抗原、抗体系统之间不发生交叉反应，为此，需要确定数对抗体的特异性及相互之间是否存在交叉反应。
2. 灵敏度高，检测线性范围广
       液态芯片检测灵敏度是ELISA的100倍以上，线性范围可达ELISA的10倍以上。如此广的检测范围以及高灵敏性与三方面的因素有关：第一，抗体的选择：既往研究显示在ELISA试验中具有良好配对及检测特异性和灵敏度的抗体不一定能够应用到液态芯片平台上，因此需要对抗体对进行优化；第二，优化交联反应条件：确定不同抗体的最佳交联量，优化交联反应的温度，以保证微球上的交联抗体密度最大化，增加抗原分子的结合量，提高检测范围和灵敏度。
3. 省时，样本用量少
       多肿瘤标志物联合检测仅需2.5-3小时，血清标本仅需10-20微升，和化学发光法相比其在标本用量上液相芯片的优势更是显而易见的，这对于某些标本难于获得的情况尤为适用。同时也降低了所需试剂、耗材、人工成本等费用，减轻了患者的经济负担。
4. 重复性好
       液态芯片检测多肿瘤标志物的精密度考察结果表明，批内CV<10％，批间CV<14％，说明试剂具有较好的重复性。
       从上述综述中可以看出，采用液态芯片方法对多种肿瘤标志物进行联合检测具有操作简单、快速、灵活、灵敏度高、检测范围广、重复性好、费用较低等优点，同时样品用量仅需10～20微升，血清测定结果与常用的免疫化学发光法相关性良好，极具开发为用于健康体查、高危人群筛查以及辅助临床诊断和治疗的免疫诊断试剂的潜力。将液态芯片技术应用到肿瘤筛查、临床肿瘤的辅助诊断及预后判断等方面，使临床医师和患者全面了解机体健康状况，有助于早期发现肿瘤，为临床提供早期诊断、治疗的依据，并将创造良好的社会效益和经济效益。有理由相信，液态芯片技术不仅能满足多项肿瘤标志物检测的需求，还将成为未来临床检验领域其它检测项目的发展方向。
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