自身免疫性肝病的自身抗体检测及报告规范

小林

                                                                                            首都医科大学附属北京佑安医院      闫惠平        摘要：自身抗体对自身免疫性肝病的诊断非常重要。抗线粒体抗体(AMA)及AMA-M2抗体是原发性胆汁性肝硬化(PBC)的诊断指标之一，具早期诊断作用，但与疗效和预后无相关性。PBC患者抗核抗体(ANA)有一定荧光模式，抗sp100和抗gp210对PBC有很高特异性。大部分自身免疫性肝炎(AIH)所出现的自身抗体缺乏疾病特异性，ANA和抗平滑肌抗体也可见于其他多种肝病。参照自身抗体将AIH分为两型，抗-SLA对AIH有极高特异性，阳性者病情多较重。自身抗体主要检测方法为间接免疫荧光法(IIF)、ELISA和免疫印迹法。ANA标准检测程序应为：IIF法对标本筛查，而后对必要者进行特异性ANA谱定量或半定量检测。自身抗体的室间质量评价是质量控制措施之一。
       关键词：自身抗体；肝硬化，胆汁性；肝炎，自身免疫性

       自身抗体(autoantibodies)是指由于各种原因导致机体产生的针对自身组织成分的抗体，可以是生理性，也可以是病理性的。正常人群中自身抗体的存在相当普遍，其作用之一就是清除体内衰老及死亡的细胞，但是生理性自身抗体一般滴度很低，只有达到一定的检测阈值才具有临床意义。近年研究表明，同一种抗原可能会诱导产生多种自身抗体，各有其特异性、表现水平也不同。由于自身抗体可出现于临床症状前几年甚至几十年，因此，无症状的自身抗体阳性人群也不容忽视，某些自身抗体持续阳性时可能预示最终会发展成为某种典型的自身免疫疾病[1]。
       自身抗体的检测技术近年得到迅速发展，使得许多过去不了解的疾病逐步被认识，临床诊治水平迅速提高。自身免疫性肝病就是这类疾病之一，本文主要针对自身免疫性肝病中原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)和自身免疫性肝炎(antoimmune hepatitis，AIH)所出现的自身抗体特征、检测意义、检测方法和规范做一些介绍。
1 自身免疫性肝病的自身抗体
       1.1 原发性胆汁性肝硬化 PBC是一种慢性胆汁淤积性肝脏疾病，其特征是肝内小胆管阻塞和血清中出现高滴度的抗线粒体抗体(anti-mitochondria antibody，AMA)。迄今为止病因不明，与自身免疫有关，好发于女性，发病年龄多在40～60岁间，罕见有儿童发病的报道。PBC主要自身抗体为AMA及AMA-M2亚型抗体、抗核抗体(ANA)等。相关自身抗体有多种，例如AMA-M4，M8，M9亚型抗体、抗着丝点抗体(anti-centromere antibody，ACA)、抗核点抗体(sp100)、抗-核孔糖蛋白(gp210)及抗干燥综合征抗体A/B(SS-A/SS-B)等。
       1.1.1 抗线粒体抗体 AMA是PBC具有诊断意义的抗体，大约90%～95%的PBC患者可以检出AMA。目前对PBC出现的AMA已有以下几个方面的认识：
       (1)AMA的靶抗原：研究证明，AMA和自身反应性T细胞的靶抗原都是2-氧酸脱氢酶复合体(2-OADC)家族的成员，包括丙酮酸脱氢酶复合体的E2亚单位(PDCE2)、支链2-氧酸脱氢酶的E2亚单位(BCOADC-E2)、2-酮戊二酸脱氢酶复合体的E2亚单位(OGDC-E2)以及二氢硫锌酰胺脱氢酶结合蛋白(E3BP)。有趣的是，PDCE2、OGDC-E2、BCOADC-E2、E3BP的免疫显性表位均为硫辛酰结合位点。这些定向抗原位于线粒体基质内膜，催化不同的酮酸底物的氧化脱羧过程。实验发现三种修饰的自身表位(epitope)可引起强的免疫反应[2]。
       (2)AMA的诊断作用：AMA及其M2亚型抗体的出现被认为是PBC诊断的三个指标之一[3]。AMA可能远早于临床症状或生化改变前就可以检测到，甚至可能在典型症状出现前10年，因此对疾病的早期诊断有重要价值。
       (3)AMA与PBC的发病和预后：AMA在PBC发病中的作用机制尚未阐明，自身抗体如何导致肝内微小胆管的损伤？广泛存在于线粒体内膜的这类靶抗原如何引起高度组织特异性的损伤？是至今不能解答的问题。对自身抗原表位的深入研究有可能解决一些PBC发病机制的困惑。AMA的消长与疾病的严重程度、疾病的进程均未见明显相关性，不能作为一种疗效监测指标。
       (4)AMA的亚型[4]：根据抗原在线粒体内膜或外膜上的位置、对胰蛋白酶的敏感性和电泳特性，可以将AMA的靶抗原分为9种亚型(M1～M9)。其中抗-M2抗体是诊断PBC的高度特异性和敏感性指标，阳性率可达到90%～95%。 M2抗体可以用免疫印迹法或酶免疫法进行半定量或定量检测。在少数慢性肝病患者和进行性系统性硬化症等自身免疫疾病中也可以检测到这种自身抗体，但以低水平为主。除了抗-M2以外，与PBC相关的其他类型抗线粒体抗体还有抗-M4、M8和M9亚型。
       1.1.2 抗核抗体(ANA) ANA出现在相当一部分PBC患者血清中，其阳性率各家报道差别较大(30%～78%)。在采用间接免疫荧光法(IIF)以Hep-2细胞为基质检测ANA时，PBC患者常见的ANA荧光模式有核膜型(nuclear membrane pattern)、多核点型(nuclear dots pattern)和着丝点型(centromere pattern)等，其抗体滴度可以很高，达到1∶1000甚至1∶10 000[5]。
       抗核膜抗体所对应的抗原主要是gp210和p62蛋白，gp210是一个分子量大约200 kD的蛋白，即核孔膜糖蛋白，它参与核心复合体成分的黏附。有报道认为，gp210抗体对PBC诊断的敏感性为25%，但是具有很强的特异性。抗-gp210的存在可能与疾病的活动度及严重程度相关，可作为预后的提示指标，阳性者提示预后不良[6]。在98.6%的PBC患者胆管上皮细胞核膜可以检测到gp210的免疫学反应，这种反应显著高于AIH和病毒性肝炎的肝标本。p62是另一种存在于核孔复合物中的糖蛋白，也是PBC的一种自身抗原，约有1/3的PBC患者出现这种抗体，它对PBC的诊断也有高度特异性。在Hep-2细胞核表现为核点型荧光染色时称为抗核点抗体，它所对应的抗原主要是sp100(多核点型)和p80(少核点型)两种蛋白。sp100为一种可溶性酸性磷酸化核蛋白。ACA的靶抗原为分裂期细胞着丝粒中的三种不同蛋白：CENP-A、CENP-B和CENP-C，其中以CENP-B更为常见。
       临床上大约5%～10%的PBC患者检测不到AMA和抗-M2抗体，我们称为AMA 阴性的PBC，这部分患者需要肝组织学特征来确诊。但是对于晚期PBC患者，在凝血机制障碍或出现腹水等情况不能进行肝活检时，上述ANA的荧光模式及抗细胞核成分的特异性抗体检测，如抗-gp210、抗-sp100及着丝点抗体有助于这部分患者的诊断。
       1.2 自身免疫性肝炎 AIH是一种原因不明的肝脏炎症，其发病机制推测为环境诱发的、免疫耐受机制的丧失以及遗传体质共同诱导一种T细胞介导的对肝脏靶抗原的攻击，导致进行性肝脏炎症坏死和纤维化形成。循环中存在自身抗体是AIH的主要诊断指标之一。
       1.2.1 AIH 的主要自身抗体 按照美国肝病学会最新颁布的《Diagnosis and Management of Autoimmune Hepatitis》[7](以下简称：自免肝指南)，血清ANA，抗平滑肌抗体(SMA)、抗肝肾微粒体抗体-1型(anti-LKM1)和抗肝细胞溶质抗原-1型(anti-LC-1)认为是AIH常规诊断的自身抗体(表1)。在北美成年人中，96%的AIH患者出现ANA、SMA，或两者兼有；4%的患者抗-LKM-1和/或抗-LC-1阳性。抗-LKM-1在英国AIH患者中阳性率看起来较高，而且不伴有ANA和SMA。遗憾的是，AIH患者的自身抗体大部分缺乏疾病特异性，虽然ANA出现的频率最高，但是不论其高滴度或低滴度都不能仅以此作为确诊指标。若常见自身抗体检测不到时，非典型的一些自身抗体，如抗中性粒细胞浆抗体(atypical pANCA)或可溶性肝抗原抗体(soluble liver antigen，anti-SLA)可以支持AIH诊断。最初认为抗SLA和抗LP(anti-liver-pancreas)是AIH中出现的两种不同自身抗体，后经研究证实为同一靶抗原，称为anti-SLA 或 anti SLA/LP，对AIH和AIH/PBC重叠综合征具有100%诊断特异性[8]。近年，SLA又被命名为 SEPSECS [Sep (O-phosphoserine) tRNA：Sec(selenocysteine) tRNA synthase]。

       作者依据北京佑安医院多年来几万例次的检测结果分析，在我国肝功能异常患者中抗-SLA和抗-LKM-1均为少见的自身抗体，尤其是抗-LKM-1阳性者罕见，在各种肝病患者中检出率不足0.1%，可能与检测对象很少有儿童有关。而在6000例各种肝病患者中检出抗-SLA阳性者18例，其中17例符合AIH的诊断，表明抗-SLA对自身免疫性肝炎具有高度诊断特异性(99.7%)[9]。
       1.2.2 AIH 的临床分型 自身抗体一直是AIH的分型依据，长期以来，将AIH分为两型还是三型一直存在争议。AIH-1型主要表现ANA和SMA，而AIH-2型以存在抗-LKM-1或/和抗-LC-1为标志，抗-SLA/LP曾被认为是AIH-3型的标志。美国肝病学会2010年自免肝指南中将AIH分为1型和2型，不再将抗-SLA作为AIH-3型的标志，认为抗-SLA可以同时见于AIH-1型或AIH-2型的患者。但是抗-SLA有可能作为判断预后的指标，提示一些重症患者激素治疗停药后易于复发。
2 自身抗体检测方法及其规范
       2.1 目前常用检测方法 IIF、ELISA、免疫印迹法、全自动化学发光法及放射免疫法等。前三种方法更多被临床采用。ANA、AMA、SMA及抗-LKM首选IIF，其中ANA、AMA和抗-LKM阳性者可以选用其他方法继续进行分型或特异性抗体的测定，包括ANA谱、抗-ENA、抗-M2/M4/M9以及抗-LKM-1型等。
       2.2 报告形式和检测程序的标准化 自身抗体测定可分为定性、半定量和定量测定。定性结果以阳性/阴性表示；IIF及免疫印记法所报告结果一般为半定量，ELISA是定量测定方法之一，定量方法以IU/ml来表示。IIF方法检测自身抗体采用滴度报告结果，不同厂家的试剂可能推荐不同的血清(浆)稀释度，也可能采用不同的稀释方法。检测结果以倍比稀释度或者以几何滴度报告结果。因此，同一份标本在不同机构使用不同试剂有可能出现不同的滴度结果。按照卫生部临床检验中心推荐的ANA检测程序：临床标本应首先采用IIF进行筛查，筛查阳性或筛查虽然阴性但患者有自身免疫病症状者，继续进行特异性抗体的检测及确认试验(定量或半定量)。
       2.3 自身抗体检测的质量控制 正确的采集和运送标本是检测前质控的关键；检测应采用标准试剂盒和标准化检测程序；参加实验室室间质量评价。卫生部临床检验中心及各地区临床检验中心要求医疗机构各个临床实验室参加室间质量评价，与其他各种检验项目一样，自身抗体检测每年定期进行质量控制的评价。例如，卫生部临床检验中心每年发放两次自身抗体质量控制测试标本，各个实验室依照自已的程序进行检测并上报检验结果，由临检中心进行最终结果的评估。自身抗体质量控制检验项目包括ANA、抗核抗体谱、抗-dsDNA和抗-ENA。卫生部临床检验中心每年向质量控制检测合格实验室发放评定成绩以及合格证书。
参考文献
[1] Shoeufeld Y, Gershwin ME, Meroni PL. Autoantibodies[M].Second Edition. The Netherlands: Elsevier, 2007.
[2] Selmi C, Cocchi CA, Zuin M, et al. The chemical pathway to primary billiary cirrhosis[J]. Clin Rev Allerg Immunol, 2009,36(1): 23-29.
[3] European Association for the Study of the Liver, EASL Clinical Practice Guidelines: Management of cholestatic liver diseases[J]. J Hepatol, 2009, 51: 237-267.
[4] 邱德凯, 马雄. 自身免疫性肝病基础与临床[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2006.
[5] 闫惠平, 庄辉, 刘燕敏, 等. 原发性胆汁性肝硬化患者的免疫学特点分析[J]. 中华肝脏病杂志, 2005, 13(1): 12-16.
[6] Hu CJ, Zhang FC, Li YZ, et al. Primary biliary cirrhosis: What do autoantibodies tell us?[J]. World J Gastroenterol, 2010,16(29):3616-3629.
[7] Manns MP, Czaja AJ, Gorham JD, et al. Diagnosis and management of autoimmune hepatitis[J]. Hepatology, 2010,51(6): 2193-2213.
[8] Wies I, Brunner S, Henninger J, et al. Identification of target antigen for SLA/LP autoantibodies in autoimmune hepatitis[J].Lancet, 2000, 355(9214): 1510-1515.
[9] 赵艳, 闫惠平, 檀玉芬, 等. 抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体在自身免疫性肝炎诊断及分型中的意义[J]. 中华肝脏病杂志, 2007, 15(4):283-286.
                                                                                                                                          编辑：范伟伟