免疫胶体金技术及其在临床诊断上的研究进展

岚峰pisces

免疫胶体金技术(ICG)是20世纪80年代发展起来的一种新型固相标记免疫测定技术。它以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，通过带颜色的胶体金颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体上直接显示出来，用于检测待测样品中的抗原或抗体 。免疫胶体金标记技术最初仅用于免疫电镜技术，近年来该方法迅速发展，应用范围也逐渐扩大，在银染色、斑点金免疫渗滤法(Dot—immtmogold Filtration Assay，DIGFA)和胶体金免疫层析诊断法(Gold Immune—chromatographic Assay，GICA)等多种免疫标记检测技术中显示出了极大的魅力 。
1 免疫胶体金技术的背景
      1857年，化学家法拉第采用还原法从氯金酸水溶液中制备出了胶体金，奠定了胶体金制备及应用的基础 。1962年，Feldherr等提出一种观点，认为胶体金可作为一种示踪标记物用于电子显微镜水平的研究。1971年，Faulk和Taylar 将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合成金标抗体，用于检测细菌表面抗原的分布，这标志着胶体金作为一种新型的有色标记物应用于免疫学领域的研究。此后，免疫胶体金技术在免疫化学领域得到广泛应用。1974年，Romano等将胶体金标记在马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法，同年，Bauer等报道了凝集素—金复合物的应用。1978年，Geoghe—gan等应用免疫胶体金技术检测B淋巴细胞表面抗原的分布。1981年，Danscher用银显影液增强了在光镜下金颗粒的可见性。1983年，Holgate等建立了免疫金银染色法(Immune Gold—sliver Staining，IGSS)，极大地提高了检测的灵敏度。1986年，Fritz等成功地进行了彩色免疫金银染色，得到了更加鲜明的视觉效果 。1989年，Spielberg等通过检测抗HIV的斑点免疫金渗滤试验，最初建立了斑点金免疫渗滤法(DIGFA)。1990年，Beggs等在免疫渗滤技术的基础上建立了一种更加简易快速的免疫学检测技术，即胶体金免疫层析法(GICA)，最先用于检测人尿和血清中的HCG。随着单克隆技术的成熟和纳米技术的兴起，免疫胶体金技术逐渐得到完善和成熟，在免疫组织化学、生物分子识别等生物医学领域得到了迅速发展和广泛应用。
2 免疫胶体金技术的原理
      免疫胶体金技术是一种新型的免疫标记技术，它以胶体金作为示踪标记物应用于特异性抗原抗体反应。氯金酸(HAuCl4 )水溶液在柠檬酸钠、枸橼酸钠、鞣酸、白磷、抗坏血酸等还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，它带负电且疏水，并且由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金 。胶体金以金颗粒为核，表面吸附了AuCl4- 和H+双离子层。胶体金颗粒在弱碱性环境中带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合，即免疫胶体金。由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性 。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子非共价结合，如葡萄球菌蛋白A、植物凝集素(PHA)、刀豆素A(ConA)、免疫球蛋白、抗生素等 。
      胶体金标记技术实质上就是蛋白质分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。由于胶体金颗粒本身呈红色，所以当免疫胶体金颗粒遇到相应的抗原或抗体时会发生反应产生聚集，在适宜条件下达到—定的密度，出现肉眼可见的红色．因而在定性或半定量的快速免疫检测方法中得到了广泛的应用 。
3 免疫胶体金技术的特点
      免疫胶体金技术是四大免疫标记技术之一，在生物医学各研究领域特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用。与其他三大标记技术(荧光素、放射性同位索和酶)相比，有以下特点：①胶体金易制备，价格低廉，成本较低；②胶体金颗粒大小可以控制，颗粒均匀，可进行双重和多重标记，同时检测多种物质；③免疫胶体金对组织细胞的非特异性吸附作用小，故具有高度特异性和高敏
感性；④不仅可用于光镜，也可用于透射电镜和扫描电镜；⑤胶体金本身有鲜艳的酒红色，检测结果直接用颜色显示，肉眼判断容易，无需仪器设备，结果直观可靠，特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及偏远地区等应用 ；⑥简化了烦琐的常规操作过程，大大地缩短了检测时间，同时也减小了因操作引起的误差。
4 免疫胶体金技术的应用
      免疫胶体金技术最初仅用于免疫电镜技术，现已发展到被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、斑点金免疫渗滤法以及免疫层析技术等。目前，该技术已广泛应用于临床诊断，尤其是医学临床检验，如早孕、乙肝、寄生虫和病毒细菌病的检测等。
      4．1 斑点金免疫渗滤法(DIGFA)   斑点金免疫渗滤法是在20世纪90年代初从斑点免疫渗滤试验基础上发展起来的，采用免疫渗滤技术、胶体金标记物和固相载体相结合的一种新的检测方法 。其基本原理是间接法或夹心法，以硝酸纤维素膜为固相载体，将试剂及标本滴加在膜上，利用微孔滤膜的可滤性，使抗原抗体反应和洗涤在一个特殊的渗滤装置上以液体渗滤过的方式迅速完成 。因其具有不需要特殊仪器设备，操作简便快速、特异性强、检出限低、斑点色泽鲜艳、肉眼即可判定实验结果等优点，而被广泛应用于环境保护、食品卫生和临床检验等领域 。
      张国庆等研究表明，用斑点金免疫渗滤法检测结核分枝杆菌抗体对肺结核的诊断，具有敏感性高、特异性好的特点；对肺结核诊断有较高的应用价值，并且操作简便、快速，与涂片法、培养法和PCR相比，有明显的优势。李岩等采用斑点免疫金渗滤法对抗乳铁蛋白多克隆抗体特异性进行检测，结果表明：金探针具有很强的选择性，该方法能准确、快速地检测出多克隆抗体的特异性。
王虹玲等建立了检测血清抗精子抗体的斑点金免疫渗滤法，检验结果表明：该法具有较好的特异性和敏感性，重复陛好，试剂稳定，操作简便快速，具有临床应用价值。洪林娣等发现用DIGFA快速检测牛布鲁氏菌病具有很好的重现性和稳定性，敏感性、特异性分别达到97％和100％ ，而且快速简便，测试过程1～2 min内完成，非常适合于布鲁氏菌病的诊断及流行病学凋查。王荣等在猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征单重斑点免疫金渗滤法的基础上，建立能同时检测HC 和PRRS 的双重斑点免疫金渗滤法，其结果易于判断，且操作简单，耗时短，与猪细小病毒、口蹄疫和猪伪狂犬病毒阳性血清不发生交叉反应。
      4．2 胶体金免疫层析法(GICA)   胶体金免疫层析技术是20世纪90年代在免疫渗滤技术基础上建立的一种简易、快速免疫检测技术。由Beggs等最先用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的测定，近年来经过不断完善，已有大量商品化试剂条得到广泛应用，它是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的 。其原理是将特异的抗原或抗体以条带状固定于硝酸纤维素膜上的某特定区域(检测带)，胶体金标记另一特异的抗原或抗体，吸附于玻璃纤维上，然后固定于硝酸纤维素膜的某一特定位置作为胶体金结合垫。当干燥的硝酸纤维素膜一端浸到样品后，由于毛细作用，样品沿着膜向上移动，当移动至胶体金结合垫(金标垫)处时，如样品中含有待检物，则发生特异性免疫反应形成免疫复合物。继续前移至检测带时，待测物和免疫复合物与之发生特异性结合而被截留在条带区域上，通过胶体金标记物而得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带，与结合标记物自动分离 (见图1)。

      吴英松等利用胶体金标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条，检测重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶，其最低检测量为1 ng。李希友等用20 nm胶体金标记新城疫抗原制成免疫层析试纸条，用于半定量快速检测新城疫抗体，检测结果与血凝抑制试验(HI)法测得结果的符合率为93．8％ ，其最小检测HI 滴度为41og2，与其他病毒的阳性血清没有交叉反应，且室温下有效保存期为3个月。陈龙宾等选择15nm胶体金标记兔抗猪瘟病毒抗体制成快速检测猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸条，试纸条与荧光抗体试验的阳性符合率为80％，总符合率为90．9％ ；与RT—PCR的阳性符合率为50％ ，总符合率为63．6％。张涛等探讨了鼠疫胶体金试剂条在动物鼠疫血清学监测中的应用，结果表明：鼠疫胶体金免疫试剂条检测的特异性高于间接血试验，可同时作为间接血凝复判中的平行试验参考。刘兆磊等建立了一种快速、简便的猪轮状病毒检测方法，即检测猪轮状病毒抗原的胶体金免疫层析试纸条，结果表明：所制备的试纸条检出病毒培养液的最低限为1：32稀释；所制备的试纸条具有一定的敏感性和特异性，重复性良好。蒋韬等用胶体金标记O型豚鼠口蹄疫抗体形成金标探针，建立了一种快速、准确检测O型口蹄疫病毒(FMDV)抗原的胶体金免疫层析方法，该方法简便、快速，具有良好的特异性和敏感性，在田间试验中，53份试验样本分别用试纸条和反向间接血凝试验进行检测，2种方法的阳性率分别为95．45％ 和90．91％。同年，蒋韬等成功研制了口蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒，从而建立了一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I 型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)，研究表明，该试剂盒具有良好的灵敏度和较好的重复性；在检测口蹄疫临床症状相似病原时无交叉反应，特异性好；O、A、Asia I 型和阴性样本的符合率分别为92．45％、91．66％ 、92．75％、100％ ，定型准确率为94．58％ 。试剂盒在4℃下可保存6个月。何丹等对
1020例血清标本同时通过酶联免疫法和胶体金免疫层析法进行乙肝表面抗原的测定，结果表明：两者对抗原的测定都是可靠准确的，完全适用于临床，两种方法各有特点，胶体金免疫层析法具有简便快捷、无须特殊设备等优点。
5 胶体金免疫技术存在的问题及展望
      胶体金免疫技术在实际研究及应用过程中仍存在一些不足之处：首先，该方法在检测过程中常出现假阳性和假阴性问题 。其次，检测的灵敏度及可重复性程度不高，检测范围需要进一步扩展。最后，因免疫胶体金技术是以胶体金纳米颗粒作为标记物，颗粒本身的一些特性也导致免疫胶体金技术的应用受到一定限制，如在操作过程中要求清洁程度高，胶体金溶液的稳定性较差，存放时间短，胶体金颗粒大，渗透能力较差等 。
      免疫胶体金技术应在解决这些问题的基础上向以下几方面发展：首先，进一步提高检测灵敏度，拓宽检测范围。为放大特异性抗原抗体的反应信号，增强胶体金的显色效果，可采用生物素亲和素系统(BAS)或免疫金银染色法(IGSS)等措施，并结合一些相应的生物传感器、电化学设备来拓宽其检测范围 。Tang等基于铂金电极修饰的胶体金提高了生物传感器检测HABS表面抗体的敏感性和稳定性。Kitano等用基于胶体金表面等离子共振效应的电感受器测定胃蛋白酶的亲和常数。其次，实现检测多元化。可采用多膜复合或单膜多元受体固定两种方式，一次检测可同时得到一组结果，节省检测时间及成本，这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值 。最后，应用反射光密度计来测量显色带或斑点的颜色强度，并将其转化为数字，以实现定量的检测。另外，还可以在NC 膜上设置多条平行捕获线，通过观察各自显色情况，将待测物含量确定在某一浓度区间内，以实现半定量检测。
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