维生素D浓度检测方法——免疫测定

岚峰pisces

维生素D缺乏和一些疾病尤其是骨质疏松症的风险增加之间的关联，近年来受到广泛重视，使测量血清或血浆中维生素D浓度的需求不断增加。在临床实验室中维生素D状态的常规检测要求分析上可靠而且成本效益好的方法。免疫测定能满足这一目的，因为它们有足够的灵敏度和特异性，易于自动化和结合到常规实验室。25-羟基维生素D浓度（25-(OH)D浓度是25-羟基维生素D3[25(OH)D3]和25-羟基维生素D2[25(OH)D2]的浓度之和）是个体维生素D状态的最佳指标。它不仅包括维生素D的内分泌生物途径，还包括旁分泌生物途径，但是活性1,25-二羟维生素D激素（1,25(OH) 2D）不提供维生素D状态的信息，而且通常是正常的或由于维生素D缺乏症相关的继发性甲状旁腺机能亢进而增加。
测量25(OH)D浓度的要求
1、代谢物识别
      虽然维生素D2补充的效用还在争论中，但是25(OH)D实验应该既检测25(OH)D，又检测25(OH)D3。众多维生素D代谢物的临床相关和血清浓度信息只是有限的。其中很多成分是构成性的或立体异构体，可以在MS方法中检测到，这些代谢物对测试结果的影响应该被最小化。
2、对参考方法的可追溯性和可比较性
      液相串联质谱法（LC-TMS）被认为是测量血清或血浆25(OH)D浓度的参考方法。免疫测定应该根据LC-TMS校准，而且应该给出可比较结果以便获得溯源性和实施维生素D补充的一般临床指导。
使用免疫测定法检测维生素D 代谢物
      25(OH)D免疫测定被设计成竞争性测定格式：25(OH)D结合剂（说明符）与25(OH)D缀合物混合，在孵育期间形成一个复合物。在孵育结束时，该复合物与反应混合物分离并被检测到。说明符可能是25(OH)D抗体或维生素D结合蛋白（VDBP）。25(OH)D缀合物可能携带这个标记用于信号产生，或者携带一个标签用于结合固相，以便分离复合物。当样本加入到试剂混合物中，血清样本中的25(OH)D与25(OH)D-缀合物相竞争，与说明符相绑定。因此随着25(OH)D浓度不断增加，信号减少而且校准曲线显示负斜率。
      分析物的疏水性，样本中VDBP的高浓度及由于广谱代谢物和变体而产生的交叉反应要求是实验开发最需要的。VDBP是血液循环中25(OH)D的主要转运蛋白。VDBP用相似的高亲和力与25(OH)D3和25(OH)D2结合，不到1% 25(OH)D是游离的。为使用免疫测定方法检测25(OH)D，25(OH)D必须从结合蛋白中释放，结合蛋白自身必须完全与样本分离或完全失活。如果释放步骤无效，免疫测定和LC-TMS参考方法之间的25(OH)D回收率的差异，取决于样本中VDBP浓度。
      大多数免疫测定用预处理程序来释放25(OH)D，除去或使维生素D结合蛋白失活。手工方法使用乙腈沉淀法，随后离心分离VDBP。沉淀法和离心法不易于自动化，因此制造商选择通过在样本中添加有机溶剂像乙醇或甲醇，碱变性和释放物质像8-
苯胺基-1-萘磺酸（ANSA）的组合来释放和灭活。然后在竞争性免疫测定检测中进一步加工预处理过的样本。

      可与参考方法相比的另一个关键因素是代谢物与变体的检测。在免疫测定中，检测到的代谢物或变体范围主要由所用抗体或结合蛋白的交叉反应模式决定。当前的免疫测定要么基于多克隆或单克隆抗体，要么基于人重组VDBP，它们对代谢物都有交叉反应性（XR）。特殊代谢物对测试结果的影响可以用XR(%)×代谢物浓度来计算。如果与分析物浓度相比，这个值较小，那么它可以被忽略。另外，如果代谢物浓度与25(OH)D浓度相关，那么系统性偏差可以通过充分的实验标准化来校正。
      目前已确定的维生素D代谢物有40多个，但对于维生素D代谢物的临床相关的认识仍是有限的，而且其血清浓度的数据也很缺乏。此外，很多代谢物不能获得用于XR测试的纯物质。1,25(OH) 2D、维生素D2、维生素D3的影响较小，因为它们的浓度或实验的XR非常低。使用具有LC-TMS确定的已知代谢物含量的人类样本，使24,25(OH) 2D3导致的平均偏差通过参考校准最小化。维生素D的C3-差向异构化途径产生具有生物活性的1,25-二羟-3-epi-维生素D3，与1,25(OH) 2D3的属性相似。因此，3Epi 25(OH)D是总25-OH-维生素D的一部分，地位与25(OH)D3和25(OH)D2平等。最后，还要考虑到常规LC-TMS方法也可能检测25(OH)D的构成成分和立体异构体，对与免疫测定的可比性产生影响。
免疫测定的未来
      免疫测定的质量和自动化程度在过去几年内显著提高。关于免疫测定的很多新25(OH)D实验已上市，易于结合到实验室常规中。有明确的趋势，要根据LC-TMS校准商业实验。在健康个体组，很多实验已显示出可接受的可比较性。
      25(OH)D浓度测量的当前发展水平提高到其他类固醇激素实验的水平，改进应关注整体及个体样本与LC-TMS的可比性，结合蛋白失活和代谢物识别是关键因素。预处理程序发展迅速，但需进一步研究代谢物识别的改进。对维生素D代谢物的认识必须延伸到人类血清中代谢物浓度的全景图及其临床意义，未来可以寻找更好的指示符—抗体或结合蛋白来调节各成分的交叉反应，以便最好地反映个体维生素D的状态。
                                                                                                  摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第一期
                                                                                                                           编辑：范伟伟