艾滋病病毒检测方法研究进展

不才

艾滋病病毒( HIV) 即人类免疫缺陷病毒, 主要侵袭人体免疫系统, 导致人体发生多种疾病。HIV 感染的诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分, 只有发现传染源才能更有效地控制艾滋病传播。要确定是否感染HIV, 只有通过检测HIV 的特异性抗体、抗原、核酸或病毒分离培养等, 而目前血清学实验仍然是实验室检测HIV 的主要方法, 但随着分子生物学技术的飞速发展, HIV 的实验室检测方法取得了很大进展。为此, 本文对HIV 抗体、抗原检测方法、核酸检测及免疫功能检测方法等的进展作一综述。
1 常规HIV 抗体检测的方法
      HIV 抗体检测分为筛查试验( 包括初筛和复检) 和确证试验 。
1.1  筛查试验
1.1.1   酶联免疫吸附试验( ELISA)   适用于大批量标本的检测, 目前是各级疾控机构及大、中、小型医院实验室筛查HIV 抗体的主要技术手段。可使用血液、唾液、尿液样品。ELISA 的基本原理是将待测抗原或抗体先固定于固相载体表面, 再用酶标记的抗原或抗体与已被固定的相应抗体或抗原发生特异性反应, 加底物显色, 用酶标仪测定结果。此方法是最常用的筛查方法, 目前国内外主要使用第三代( 双抗原夹心法) 试剂, 几乎不用第二代试剂。血源筛查仍以第三代ELISA为主, 国际上有些国家和地区已将第四代ELISA 试剂用于血源筛查。第四代ELISA 试剂可同时检测P24 抗原和HIV - 1 /2抗体。与第三代HIV - 1 /2 抗体试剂相比, 检出时间提前了4~ 9d。其优点在于可同时检测抗原和抗体, 降低血源筛查的残余危险度 。
1.1.2   化学发光或免疫荧光试验   这类试剂采用发光或荧光底物, 既可检测抗体, 也可联合检测抗原抗体。HIV 抗原或抗体包被于固相载体, 加入待检样品和酶或荧光标记的HIV 抗原或抗体, 加发光或荧光底物, 用发光或荧光仪测定结果。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。
1.1.3   快速检测( RT) 及其它检测试验这类试验简便快速,适用于应急检测、门诊急诊检测。一般可在10 ~ 30min 内得出结果。
1.1.3.1   明胶颗粒凝集试验( PA) 是HIV 血清抗体检测的一种简便方法。将HIV 抗原致敏明胶颗粒作为载体, 与待检样品作用。当待检样品含有HIV 抗体时, 明胶颗粒与抗体发生凝集反应, 根据凝集情况判读结果。PA 试剂有2 种: 同时检测HIV - 1 和HIV - 2 抗体以及分别检测HIV - 1 和HIV - 2 抗体。有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定。
1.1.3.2   免疫渗滤试验  斑点ELISA 和斑点免疫胶体金( 或胶体硒) 快速试验, 均以硝酸纤维膜为载体, HIV 抗原点状固定在膜上, 加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10min 以内。有效试验的质控点必须显色。
1.1.3.3   免疫层析试验  以硝酸纤维膜为载体, HIV 抗原线状固定在膜上, 待检样品( 血液或唾液) 沿着固相载体迁移,阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。免疫层析试验还可在固相载体的不同部位包被不同的抗原来检测HIV - 1 M 亚型及O 亚型 。虽然免疫层析试验灵敏度不及酶联免疫吸附试验。但由于该法具有试剂无需冷藏、步骤简捷、无需任何仪器设备及容易解释结果等特点,适合于基层实验室筛查使用。
1.2   HIV 抗体确证方法
      包括免疫印迹试验( WB) 、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验( RIPA) 及免疫荧光试验( IFA) 等。
1.2.1   免疫印迹试验( WB)   目前国内最常用的诊断HIV感染的确认检测方法, 也是《全国艾滋病检测技术规范( 2009 版) 》中的首选确认方法, 其敏感性和特异性均很高,用来对筛查试验阳性的标本进行鉴定。其基本原理是将提纯的HIV 颗粒裂解为不同的组分, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳, 病毒的不同蛋白在电泳中按分子大小排列开, 在电场力作用下转移到硝酸纤维素膜上, 再与特异性抗体孵育, 洗去游离抗体,然后和酶标记的二抗孵育, 再进行底物显色, 根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。WB 虽作为HIV抗体确认的首选方法, 但依然有一定的局限性, 有文献报导,操作不当和误判带型的假阳性率> 2%。另有文献报道4%~ 20%的样品经过HIV 初筛复检阳性后, WB 结果为“ 不确定”。相当数量的“不确定”样品与P24 条带有关。一种可能的解释是与非特异性抗体有关 。
1.2.2   条带免疫试验  条带免疫试验的原理和操作方法与免疫印迹试验十分相似, 区别仅在于条带免疫试验条膜上的抗原是重组或化学合成的多肽的抗原, 而且是人工固定在条膜上的。
1.2.3   免疫荧光试验( IFA)   将HIV 感染的淋巴细胞固定在玻片上作为抗原, 与待检血清反应后加入荧光素标记的抗人免疫球蛋白, 洗去未结合的荧光抗体, 在荧光显微镜下观察结果, 如阳性标本会在细胞浆内出现特异性荧光。IFA 法经济、简便、快速, 曾被FDA 推荐用于WB 不确定样品的诊断。但需要昂贵的荧光显微镜, 观察和解释结果易受主观因素影响,结果不宜长期保存, 不宜在一般的实验室开展和应用。
1.2.4   放射免疫沉淀实验( RIPA)   将放射性同位素标记的氨基酸加到感染HIV 的细胞培养基中, 随着病毒的复制,这些标记的氨基酸就进入病毒的蛋白中, 收集含有同位素的病毒颗粒, 用去垢剂将细胞溶解, 再用抗IgG A 蛋白琼脂糖去除有反应性的细胞抗原。将所得的上清液( 含有病毒蛋白) 与待检血清混合, 如有HIV 抗体, 则同位素标记的HIV 抗原与之结合形成沉淀。用SDS - PAGE 电泳将沉淀物中的病毒蛋白按照分子量大小分离开来, 并与已知的分子量标准比较。用这个方法可检测HIV - 1 的160、120、66、51 ~ 55、41、31、24和17kD 的蛋白抗体。这是目前最具敏感性和特异性的HIV 抗体检测方法, 但这种方法费时多、技术难度大, 且需使用同位素, 一般仅用于研究而非实验室常规使用。
2 HIV 抗原检测
      检测HIV - 1 抗原指的是检测HIV 的核心抗原P24。HIV侵入机体后, 核心抗原P24 的水平随着病毒RNA 水平的发展而发展, 并在急性感染期出现, 通常被认为是病毒复制的间接标志, 与病情发展密切相关。因此, 血液及其它体液标本中P24 抗原的检测可缩短窗口期, 有助于HIV 的早期诊断、预后判断及评价抗病毒治疗的效果, 具有良好的实际应用价值。目前HIV P24 抗原检测一般用抗体夹心ELISA 法, 有定性检测和定量检测。定性检测又包括筛选试验和确证试验, HIV - 1 P24抗原筛选试验有反应的标本必须经过中和试验确证以才能判断阳性或阴性。其结果阳性仅作为HIV 感染的辅助诊断依据,不能据此确诊, 而阴性结果也不能排除HIV 感染。此法简便易行, 但灵敏度较差, 50% ~ 80%。由于ELISA 本身的局限性以及P24 抗原检测在HIV - 1 诊断中的重要作用, 近几年来国内外对建立高灵敏度检测P24 抗原的研究一直未曾停止。先后研发了免疫复合物解离P24 抗原测定法( immune complex dis associate, ICD) , 信号放大增强ELISA ( signal amplification boosted ELISA) , 线性免疫酶测定( linealimmunoenzymatic as say , LIA) 超敏感酶免测定法( ultrasensitive enzyme immunoas say , UEI) , 免疫吸附电镜法( immunosorbent electron micro scopical method, ISEM) 和纳米粒子生物条形码检测技术( nanoparticle based biobarcode amplification assay , BCA) 等。有研究表明, ICD 的敏感性已提高到90%  , 而LIA 最敏感的抗原检测试剂盒的检测阈值为0.01pg /mL 。随着检测技术的发展, 这些新技术将有很好的应用前景。
3 HIV 核酸检测
      HIV 核酸检测有定性和定量2 类, 定性检测通常使用PCR或RT - PCR 技术, 一般使用扩增HIV gag 和/或pol 和/或env和/ 或LTR 等引物。进行RNA 逆转录时可使用下游特异性引物或随机引物。引物设计可参考文献或自行设计, 应尽量涵盖常见的HIV 流行毒株, 也可使用兼并性引物。HIV 核酸检测阳性, 可作为诊断HIV 感染的辅助指标, 不单独用于HIV 感染的诊断; HIV 核酸检测阴性, 只可报告本次实验结果阴性,不可排除HIV 感染。定量检测通常是HIV 病毒载量检测, 常用于监测HIV 感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。目前常用的HIV RNA 定量测定方法有逆转录PCR 实验( RT - PCR) 、核酸序列扩增实验( NASBA) 、分支DNA 杂交实验( bDNA)和实时荧光定量PCR 等。随着分子生物学技术的发展, 核酸检测越来越受到人们的重视, 这就促进了应用PCR 技术进行HIV 核酸检测的快速发展, 通过这种技术, 不但可进行定性检测, 还可进行定量检测。该技术具有特异性强、灵敏度高等许多优点, 但由于所需的试剂、仪器昂贵, 费用高, 难以承担,欲将该技术真正运用到常规检验工作中存在相当难度。
4 HIV 耐药检测
      HIV 耐药检测的方法可分为基因型和表型2 大类检测法。HIV 耐药基因型检测法基于对耐药相关基因突变的检测, 利用耐药基因型解释系统判断是否耐药以及耐药程度; HIV 耐药表型检测法基于体外培养技术, 通过检测抑制病毒生长所需的药物浓度( IC50 或IC90) , 并与参考株进行比较, 判断病毒对药物的敏感程度。常用的HIV 耐药检测方法为基因型检测法,通常使用逆转录PCR ( RT - PCR) 和测序方法。HIV 耐药检测用于HIV 感染人群和抗病毒治疗人群的耐药性监测和检测及个体患者的耐药检测。
5 CD4 + 和CD8 + T 淋巴细胞检测
      CD4 + 和CD8 + T 淋巴细胞计数的方法分为2 大类, 一类是应用流式细胞仪测定法, 另一类是非流式细胞仪测定法。常用的方法为流式细胞仪。通过CD4 + T 淋巴细胞计数可评价HIV 感染者免疫状况, 辅助临床进行疾病分期; 可作为儿童免疫抑制分级指标及临床治疗分期和辅助条件; 可评估疾病进展和HIV 感染者机会性感染的风险; 可判断预后状况和辅助判断是否进行预防性治疗; 可作为是否开始抗病毒治疗和判断免疫系统恢复情况的重要实验室指标之一。CD8 + T 淋巴细胞为抑制性/ 细胞毒性T 细胞, HIV 感染者CD8 + T 细胞数量增加,导致CD4 /CD8 比值下降, 有文献报导, CD4T 淋巴细胞/ CD8T淋巴细胞比值通常为2, 若该值小于1 则提示细胞免疫状况不佳, 比值越低说明免疫缺陷越严重。
6 HIV 的分离培养
      一般采用靶细胞( HIV 阴性者外周血淋巴细胞, PBMC)与受检者标本( PBMC、全血、血浆、精液及其他体液) 共培养的方法, 最常用的方法是PBMC 共培养。样本首选新鲜抗凝全血, 也可使用血浆、精液及其他体液, HIV 分离培养阳性可确证为HIV 感染, 分离培养阴性不能排除HIV 感染。HIV 的分离培养可作为HIV 抗体不确定或HIV 阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断; 可用于HIV 表型耐药检测及其他HIV 生物学特征的研究; 还用于HIV 感染的辅助诊断。
7 HIV - 1 新近感染检测
      HIV 常规抗体检测方法可判定感染和未感染状态, 新近感染检测方法则用于识别近期感染与既往感染。目前, 检测HIV新近感染的血清学方法中, 研究和应用最多的是BED - EIA HIV - 1 捕获EIA 方法( BED - CEIA) , 其原理是根据HIV 特异性IgG 占总IgG 抗体的比例随着感染时间的延长而逐渐增高。应用BED - CEIA 进行新近感染检测只适用于HIV 阳性样品。由于个体间抗体生成的变异性, 对个体而言, BED 结果的预测值偏低, 而且在个体水平上BED 检测可能产生一定的假阳性和假阴性, 但在人群水平上, 假阳性的数目与假阴性的数目相近, 因此可相互抵消彼此的作用。美国FDA 将BED -CEIA 归为“只应用于监测目的, 不能用于个体诊断和临床”的实验方法。
      以上介绍了艾滋病病毒各种检测方法, 不同的方法有其优缺点, 临床应用也各异。总之, 随着感染者不断增加、感染人群的变化和临床病人的日益增多, 艾滋病检测工作量逐渐加大, 新的监测和检测需求也不断增加, 这就要求广大科研工作者在今后的工作中要有创新精神, 不断探索, 研究开发灵敏度高、特异性强、检测速度快、操作简便的检测方法或检测试剂, 使其既能满足艾滋病检测工作的实际需要, 又能体现检测技术的发展, 缩短检测的窗口期, 避免漏检, 以更有效地遏制艾滋病的蔓延, 保护广大人民群众的身体健康。
                                                                                                                                  本文编辑：范伟伟