原发性肝癌血清标志物研究进展

沉默

      原发性肝癌主要包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管细胞癌(ICC)和肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型等不同病理类型，由于其中HCC占到90%以上，故本文所指的“肝癌”主要是指HCC。截至目前，肝癌仍旧是世界上致死率最高的恶性肿瘤之一，肝癌的发生率在世界范围内持续升高。肝癌的早期诊断和早期治疗是重中之重。30多年来，临床上应用甲胎蛋白(AFP)作为肝癌标记物，对肝癌的诊断起了重要的作用，但是其敏感性和特异性都不十分令人满意。研究新的血清学标志物，提高肝癌早期诊断的敏感性和特异性具有重要的意义，在过去几年内，基因组学，糖蛋白组学、肿瘤自身抗体等领域的发展使得若干新型的标志物被发现和研究，肝癌早期血清标志物的解决方案呼之欲出，许多新型的血清学标志物具有很好的应用前景，本文对上述方面的研究进展做一综述。
1. 单个血清学指标
1.1 甲胎蛋白（AFP）及其异质体AFP-L3
      甲胎蛋白（α-fetoprotein,αFP或AFP）对肝细胞癌仅有相对特异的诊断价值，经过临床长期广泛的应用后，在早期肝癌的诊断中暴露出了一定的局限性。有些欧美学者认为AFP的敏感性和特异度不高，2010版美国肝病研究学会(AASLD)指南已不再将AFP作为筛查指标。AFP对早期肝癌AFP的阳性率大约30-40%；总HCC的敏感性在60%到70%，而特异性在70%～90%，并不能满足临床对HCC诊断的要求；特别是AFP在慢性肝炎、肝硬化和其他恶性肿瘤中AFP也有升高，所以AFP作为HCC诊断指标的应用价值已受到质疑。而目前认为，与小扁豆凝集素（LCA）结合的AFP异质体L3具有优于AFP的诊断价值，因为它是肿瘤细胞特异性分泌具有特殊糖链的AFP蛋白，具有更好的特异性，AFP-L3/AFP>10%即可诊断原发性肝癌，其灵敏度和特异性分别为55～70%和大于95%，是独立于总AFP的肝癌诊断指标，具有非常重要的临床意义，国内外都已经有商品化的AFP-L3试剂广泛应用于临床。
1.2 异常凝血酶原（DCP）
      凝血酶原（凝血因子II）为正常肝细胞分泌，是一种维生素K依赖性凝血蛋白，在维生素K作用下，凝血酶原可羧化成为γ- 羧基谷氨酸，发挥其在凝血中的生理作用。但当患者体内维生素K 缺乏时，羧化过程所需羧化酶活性减低，导致凝血酶原不能正常羧化，从而产生异常凝血酶原（DCP）。HCC患者血清中出现高水平DCP，因此DCP被认为是HCC血清学诊断指标，该项目在过去曾被认为敏感性和特异性较低，但最近的研究成果又提示该项目具有一定的诊断价值，如DCP可以和AFP或者AFP-L3联合使用以区分原发性肝癌和肝转移癌，该项目目前已经被NCI的早期诊断研究网络(EDRN)列为肝癌血清学标志物之一。
1.3 磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（GPC-3）
      GPC-3是一种肝细胞表面糖蛋白，为肿瘤抑制因子，在肝癌细胞中高表达而在正常人和肝炎患者肝细胞中不表达，主要在胚胎发育过程中参与调节细胞增殖。GPC-3对HCC诊断价值较高，研究表明其AUROC为0.892，cut-off值为26.8ng/mL时其敏感性为51.5%，特异性可达到92.8%。Qiao SS等将GPC-3和AFP及其他项目组合，可以将敏感性提高至80.2%，远高于AFP单独的诊断价值。
1.4 转化生长因子-β1 (TGFβ1)
      TGFβ1是一个多功能的细胞因子，在HCC细胞中表达增加，同时在患者血液循环中也可检测到TGFβ1浓度的增加。El Bassuoni MA 等研究了HCC患者血清中TGFβ1 mRNA及蛋白质的表达水平，发现HCC组患者同对照组相比有显著升高，并且TGFβ1与肝脏纤维化的程度也呈相关性，但是TGFβ1对HCC诊断的特异性有限，在伤口愈合，血管新生，纤维化形成及肝外肿瘤中，TGFβ1表达也有上调，这样的缺陷也使该项目的应用受到了限制。
1.5 胰岛素样生长因子-II（IGF-II）
      IGF-II又称生长调节素A，是一个单链多肽分子，与胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factors I，Igf1)在氨基酸组成上具有同源性。IGF-II在细胞增殖、分化、凋亡和转化中具有重要作用，现证实IGF-II与HCC的发病机制有关。在肝癌患者和实验动物血清中均发现IGF-II浓度增加。Rehem RN等的研究结果发现，IGF-II和AFP一样，在HCC患者血清中显著升高，对肝硬化和肝癌具有鉴别诊断价值，同时，在慢性肝病的诊断分级中也具有一定价值。
1.6 高尔基体蛋白73（GP73）
      GP73为高尔基体特异性膜蛋白，在HBV和HCV感染相关的肝细胞癌患者血清中浓度显著升高；Marrero 等研究了GP73在HCC中的诊断价值，研究样本为352例患者的血清，其中144例患有肝癌，152例为肝硬化患者，研究结果显示，在cut-off为10(RU)时，其敏感性为62%，特异性为88%。2011，Mao等对4,217例样本进行了研究，其中包括789例原发性肝癌患者，427例HBV 或者HCV携带者，614例肝硬化患者，1,690例正常人血清样本作为对照，研究表明，cut-off值为8.5 RU时，其敏感性为74.6%，特异性可达到97.4%，并与AFP，IL-6，和鳞状细胞癌抗原（SCCA）对比，对其进行了精密度的趋势分析，结果显示：与其它3个生物活性标记物的精密度进行对比，GP73明显高于AFP(p = 0.006；95% CL -0.23，-0.12)，
IL-6与AFP相似(p = 0.66; 95% CL -0.31，0.25)，SCCA高于AFP（p = 0.001; 95% CL 0.12，0.23）。通过研究，研究者们得出的结论是：GP73是一个有价值的血清标志物 [13]。商品化的GP73酶免定量试剂在国内外已经都可以获得用于科研或者临床。
1.7 肝细胞生长因子（HGF）
      HGF为一多功能的细胞因子，主要与有丝分裂，细胞运动等过程相关。Miyahara K等研究了多个不同的血清学标志物对HCC的诊断价值，发现在HCC患者血清中HGF显著升高，高浓度的HGF患者生存时间显著降低，其风险比率为2.55，但是，在其他类型的疾病，如食管鳞状细胞癌，恶性淋巴瘤，冠状综合征，主动脉夹层动脉瘤，脓毒血症等疾病中HGF浓度也有升高，所以需要排除是否因为炎症反应导致HCC患者血清中HGF浓度的升高。
1.8 白介素6（IL-6）
      IL-6为一种多功能的细胞因子，在造血及各种组织来源细胞的分化方面起关键作用，肝细胞表达的IL-6在HBV所表达的X蛋白作用下上调，该细胞因子在肝硬化时高表达，在HCC时的表达情况也有不少研究。Porta等研究了其在HCC中的诊断价值，发现在cut-off为12pg/mL时其敏感性为73%，特异性为87%，Hsia等[16]的结果则为cut-off 3g/mL敏感性为46特异性为95%。
1.9 鳞状细胞癌抗原
      鳞状细胞癌抗原（SCCA）是丝氨酸蛋白酶抑制剂，表达于很多正常鳞状上皮细胞，在头颈部肿瘤及其他上皮性肿瘤组织中水平升高。Hussein的课题组研究了在HCC及肝硬化和正常对照组人群中SCCA水平的变化，发现SCCA在HCC组患者血清中浓度显著升高，cut-off值为0.3 ng/ml，其敏感性和特异性为100%和7%，而cut-off值为1.5 ng/ml时，其敏感性和特异性为39%和100%，如果组合AFP和SCCA可取得更好的诊断效果。
2. 蛋白质组策略
2.1 血清蛋白质组学
      血清蛋白质组学研究通常采用双向凝胶电泳检测，但该方法对低丰度的蛋白敏感性较差。Steel的研究团队利用该技术比较了HBV导致HCC患者血清中蛋白质浓度情况，同时采用HBV携带者和HBV阴性患者作为对照，结果发现，患者血清中C3补体和APO A1两个蛋白含量显著偏低，但在HBV携带者血清中上述两个蛋白也降低，说明这两个蛋白浓度的改变并非HCC特异性的。该研究小组后续又报道了血清前淀粉样P片段降低可能与HCC患者相关，但该蛋白浓度轻微改变是否对HCC的诊断足够敏感和特异仍值得商榷。最近的文献中，Poon等采用SELDI-TOF方法对38例HCC患者和20例慢性肝炎对照患者进行了研究，并鉴定了250个HCC特异性血清蛋白质，并可使对HCC诊断的敏感性和特异性达到90%左右，这超越了目前所报道的所有单一血清标志物的诊断水平。Ward等对此做了相似的研究，并鉴定了免疫球蛋白κ和λ轻链可作为HCC的标志物，并有94%的敏感性和86%的特异性。Schwegler的研究小组把SELDI-TOF结果和AFP、DCP及GP73进行联合诊断HCC，发现可以提高诊断的敏感性和特异性，虽然研究结果没有Poon小组的好，但也优于多数单指标检测的结果。但是，SELDI-TOF方法也存在一定的缺陷，例如它对目标蛋白缺乏鉴定能力以及重复性有待提高，所以该技术为HCC诊断的应用价值还有待技术的进
一步成熟。
2.2 血清糖蛋白组学
      血清蛋白质的肿瘤特异性糖基化改变已被广泛研究，Comunale及其同事最近报道了HBV相关HCC土拨鼠模型血清核心岩藻糖基化血清蛋白质浓度的升高。同时，他们对其他类型HBV相关肝病进行了研究，并得出许多高丰度蛋白与AFP和GP73有相似的改变，包括血色素结合蛋白，α酸性糖蛋白，α-1-抗胰蛋白酶和结合珠蛋白等。所以，检测肿瘤患者血清蛋白质的岩藻糖基化可能成为鉴别HCC和正常患者的新型标志物，该方法目前看来前景令人期待，而且检测ELISA试剂也正在研发的过程中。
2.3 组织蛋白质组学
      肝组织的蛋白质组学通常也采用双向电泳或蛋白质质谱技术进行研究，Li等对HBV相关HCC患者肝脏蛋白质组进行了全面的分析，共鉴定出80种差异表达的蛋白，并按功能进行了分类，少数蛋白如增殖细胞抗原，stathmin1等利用蛋白免疫印迹法进行了鉴定。Kim等证实了NPM在HCC组织中的上调但认为PDI也是明显上调的。除上述文献外，研究者们还做了很多关于此类的工作，但是，是否能保证诊断结果准确性还不能确定，另外，在肝脏组织中发现的表达差异蛋白是否能用于血清学的诊断还需要进一步验证。
3. HCC特异性自身抗体
      在HCC患者血清中存在着肿瘤来源的自身抗体（TAA），如早期发现的抗-P53抗体和新发现的抗端粒酶抗体等。TAA可能是肿瘤恶性化的标志，因为它们在恶性肿瘤形成过程中出现。HCC的TAA敏感性较低，在正常人群中没有该抗原检出，而在患者中也只有大约1/5可检测到，但是，TAA的特异性却是很可观的-接近90%，比传统的肿瘤标志物如AFP或DCP要好，而不足之处在于缺乏肝脏特异性，在各种恶性肿瘤中都存在。通过统计学方法将多种TAA进行组合可提高敏感性和特异性，如有研究将c-myc、Koc和 cyclin进行组合，取得了不错的诊断效果。Hann等建立了检测5种TAA的ELISA方法，并对HCC，肝硬化和慢性乙肝患者进行了检测，发现三组阳性率分别为80%、32%、7.5%，检测TAA对HCC的诊断具有预测作用，即使在AFP正常的患者中，往往也可发现TAA浓度的异常，基于该特性，研究具有风险预测功能的TAA组合具有广阔的前景，而目前尚无大规模临床试验数据发表。
4．分子生物学标志
      循环核酸（CNA）是一种细胞外游离状态的核酸，肿瘤患者血浆／血清中存在循环DNA、RNA和微RNA，具有片段小和含量低的特点，检测患者血浆中CAN可对患者的不同病理状态进行监控，对恶性肿瘤的血清学标志提供了新的研究方向。
4.1 AFP mRNA
      早期研究报道了可用RT-PCR的方法检测循环中的HCC细胞，其靶位点及是AFP mRNA，该研究成果使AFP mRNA成为HCC血清学标志物新的研究热点，研究结果表明，HCC血浆AFP mRNA阳性患者术后复发间期要远短于阴性患者，meta-分析结果显示AFP mRNA术后1周的表达与HCC复发具有相关性。
4.2 GGT mRNA
      与AFP mRNA相似，GGT mRNA也可在肝病患者及正常人体内检测到，包括两种类型，A型和B型，其中B型为主要类型，提示GGTmRNA表达的改变与HCC进展有关，并且B型GGT mRNA阳性的患者，在HCC及慢性肝病患者都会出现复发早，死亡率高的情况。
4.3 IGF-II mRNA
      异常的IGF-II mRNA表达可作为HCC诊断，鉴别，转移和术后复发监测的血清学指标，该指标在cut-off值4.1mg/g时，敏感性63%，特异性90%，准确度为70%，可作为AFP诊断小肝癌的辅助指标，联合二者其敏感性可达80%，准确性达88%。
4.4 白蛋白mRNA
      白蛋白是肝脏合成的主要蛋白质，白蛋白mRNA在血浆中能检测到，可作为肝脏疾病的敏感指标。Cheung的研究小组发现肝移植患者血浆白蛋白mRNA水平升高与复发率具有相关性，其预测2年复发率的敏感性为73%，特异性为70%。
4.5 MicroRNA
      MicroRNA也可以作为HCC诊断和监测的血清学标志物，该项目可准确预测HCC患者的生存期和肿瘤扩散情况，同时可以对肿瘤分级分期具有一定的价值。现在已有很多学者对m i R N A进行了研究，Moemen AK Abdalla等对HCCMicroRNA进行了研究，发现了两个差异表达的miRNA，其靶基因可能与HCC的进展有关，对HCC高风险患者检测结果表明，其中miR-618检测HCC敏感性为64%，特异性68%，miR-650为72%，特异性58%，miR-618/650为58%和75%，高于传统的血清学指标AFP，该指标对HCV感染高风险患者具有预测作用，对肝癌早期诊断，特别是对于丙型肝炎病毒阳性患者发病前的诊断、预测，具有重要的价值，并且，在尿液中可进行检测，具有无创性。
小结
      目前对HCC诊断的标志物研究发展较快，很多新兴的标志物们被研究者发现，具有取代灵敏性和特异性都不佳的AFP的趋势，包括血清蛋白质组学和分子诊断标志的研究具有广阔的应用前景。严格遵循EDRN的筛选规则有助于正确评价标志物的诊断价值并最终实现临床应用。
                                                                                               摘自定向点金《临床实验室》杂志2012年第六期
                                                                                                                    编辑：范伟伟