监测尿液中确定阿司匹林药效的ELISA测试

岳光

阿司匹林是被广泛用于防止心血管疾病的辅助处方。它可以抑制血栓素A2 (TxA2) 的生成，而TxA2可以有效收缩血管，促进血小板凝聚。虽然每年全世界有上百万人在服用阿司匹林，但最近的研究显示并非所有个体对阿司匹林的反应都是一致的。
      目前以血液为基础的阿司匹林药效的测定方式是分析体内给药后血小板活化情况。这些测定方式需要特殊的设备，具有入侵性（它们需要全血），会受到外部因素如温韦伯氏因子水平、凝血因子VIII和红细胞比容管的影响。本文论述了另一个新型的酶联免疫化验(ELISA) ，可以测定稳定的尿液排泄物血栓素A2, 即11-脱氢血栓烷B2(11dhTxB2)。
      本测试具有优良的分析性能，临床实验室仅需具备常见的ELISA设备即可。有证据显示该检测可以精确地、无创性方式对那些可能不会受益于阿司匹林治疗的个体进行鉴定。
阿司匹林和心血管疾病      冠状动脉、脑血管、外周动脉的粥样血栓位于全球人类疾病发病率和死亡率的前列，并且不断增长。其中关键的原因之一就是粥样硬化血栓成分为活化和聚集的血小板。因此抗血小板治疗成为治疗该类疾病的主要方法。抗血小板治疗的主要机制是乙酰水杨酸(ASA)或阿司匹林抑制环氧合酶路径。ASA的抗血栓效应在很多年前已被了解。
      阿司匹林有良好的药力水平记录。一项研究表明在患有动脉血管疾病的患者中，低剂量的阿司匹林会使心血管疾病的发生率降低25%。同样，根据最近的另一个报告，在高危动脉血管疾病患者中，阿司匹林的治疗可降低34%非致命的心肌梗塞，25%的非致命心绞痛，18%所有原因的死亡率。
      阿司匹林可以在血小板环氧合酶-1(COX-1)上不可逆转的添加乙酰基，这样可以抑制它的活性从而延长血小板的寿命。 阿司匹林也抑制COX-2——炎症刺激产生的环氧合酶的同分异构体，但抑制程度比COX-1小。低剂量阿司匹林可抑制95%的血小板COX-1活性。 这个结果在生成TxA2时降低。
阿司匹林耐药性
      虽然已经清楚了阿司匹林对于COX-1的抑制机制，但目前的报告显示，并非所有的患者对于低剂量阿司匹林的治疗反应程度都相同。对ASA反应的缺失使人们历史性的提及了阿司匹林耐药性，而且其能随着诊断方式的不同而发生变化。
      变化范围较广的原因是阿司匹林耐药性很精确，范围包含服用阿司匹林发生缺血的患者（临床耐药），也有未出现TxA2水平降低、血小板活化或凝集的患者（生化耐药）。
      阿司匹林耐药性的根本原因——可能说阿司匹林无应答更好一些——可能有几个，包括遗传变异、压力诱导血小板流通增强、血小板活化其他路径、血栓素生成其他途径（例如通过单核细胞或巨噬细胞的COX-2）阿司匹林可吸收性等等。
      最近的研究显示，使用血液血小板凝集方式和尿液11dhTxB2测定冠心病以及相关的患者时，其胆固醇、甘油三酯和C反应蛋白水平对阿司匹林的反应会降低。与无症状的患者相比，冠心病患者服用阿司匹林后显示出显著较高的尿液11dhTxB2水平。忽视无应答的原因，患者对于阿司匹林反应的可变性逐渐清晰。
实验方式
      由于患者对ASA的反应有差异，因此我们需要一种可靠的方式分析个体对阿司匹林的特异反应，帮助临床医生确定是否需要改变治疗措施。现有的测定阿司匹林药效的两个基本方式：血小板聚集法和尿液11dhTxB2 测定法。
      血小板聚集法有很多形式，虽然这些检测相对较快，但它们对变量很灵敏，而这些变量又往往与阿司匹林药效无关，如温韦伯氏因子水平、因子VIII以及红细胞比容管，事实是血小板的活化仅需调节温度即可。最近一项研究比较了这两个方式，结果显示它们之间一致性很低的原因就在于此。
      另外，其他的血小板聚集方式需要特殊的设备，限制了医师在一个检测程序中运行大量样本的能力。由于此原因或者其他列举的原因，直接测定TxA2的代谢物对于确定个体对阿司匹林的反应更为适宜。
11-脱氢血栓烷B2
      阿司匹林除了作为一种普遍使用的止痛药，也因其对TxA2合成的抑制作用以及最小的成本和防止缺血方面的临床效用，成为广泛使用的抗血小板处方药物。直接测定患者对阿司匹林的反应是指测定TxA2的循环水平。不幸的是，TxA2在血液中的寿命很短，这样分析TxA2就非常困难，但是它会在酶的作用下分解成很多代谢物包括11d h T x B 2和11 -去氢-2 , 3 - d i n o r 血栓素B2 (11dh2,3DTxB2)。这些代谢物被肾脏吸收，排泄在尿液里。11dhTxB2在尿液中非常稳定，是TxB2在尿液中最丰富的代谢物，它循环时间相对较长，为45分钟。
      为了确定尿液11dhTxB2作为血栓素测定的适用性，对TxB2代谢进行了研究。实验中，与测定血液TxA2相比，尿液11dhTxB2水平为体内血栓素代谢提供了更加精确的指示。前一种方式会在血液收集过程中面临技术困难，所以尿液11dhTxB2数量以及它的分解形式——11dh2,3DTxB2可作为测定TxA2生成的最佳途径，并可对体内血小板活化做出精确的检测。
      最近一项重要的研究中，采用两种不同血小板凝集方式获得尿液11dhTxB2，用来比较阿司匹林的治疗方案，该研究将测试结果与动脉硬化风险因子结合考虑。研究中，处于冠心病增高风险的无症状患者每天摄取81mgASA，持续两周。同时，研究人员获得其尿液样本，确定其11dhTxB2水平。同时也进行血液样本收集，采用血小板凝集方式分析。根据除阿司匹林反应之外其他动脉硬化风险因子的出现或消失来评价患者。
      分析比较的结果显示，只有未应答个体的尿液11dhTxB2水平与心血管风险相关性较大，血小板凝集平台不能显示这种关系。
11dhTxB2 ELISA 试剂盒
      与战略伙伴Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI)和 Creative Clinical Concepts (Denver)合作， Corgenix Medical Co.(Broomfield, CO) 已经开发出一种称为AspirinWorks Test Kit的ELISA试剂盒用于检测尿液中的11dhTxB2 。这是一个竞争性化验，微量滴定板孔包被着羊抗鼠IgE抗体 (图1)。

      图1. 由Corgenix Medical Co. (Broomfield, CO) 及其合作伙伴开
发的AspirinWorks ELISA试剂盒反应原理。标准物和样本添加至包
被了羊抗鼠IgG抗体的孔内，再添加11dhTxB2指示剂和11dhTxB2
单克隆抗体，2小时孵育后，清洗孔并添加底物，30分钟添加终
止液，使用酶标仪读数。光密度与样本或标准物内的11dhTxB2数
量成反比。
      检测开始时向孔内放入标准品和样本，添加11dhTxB2指示剂。指示剂是11dhTxB2 与碱性磷酸酶共轭物，然后添加鼠单克隆11dhTxB2 抗体开始反应。在两小时孵育期间，11dhTxB2 和11dhTxB2 指示剂会竞争性结合到鼠抗11dhTxB2 抗体上，之后抗体被包被的羊抗鼠IgE抗体捕捉至孔上，清洗微量滴定板孔除去未结合的酶。接下来检测人员添加p-硝基苯磷酸(pNPP) 底物，孵育30分钟，再添加0.1M的终止液乙二胺四乙酸(EDTA)结束颜色反应，然后此板在标准微量滴定板读数器405nm进行读数。对于含有较高水平的11dhTxB2样本，会有较少的11dhTxB2 指示剂结合至单克隆抗体，结果产生较低的光密度(OD)。样本中的11dhTxB2 较少时，会有较多的指示剂结合至抗体，产生较高的OD读数。11dhTxB2 的真正浓度是通过对比临床样本OD值和包装随带的定标液建立的参考曲线获得的。试剂盒均值的数值表达方式为每毫升样本××皮克11dhTxB2 。
      测试尿液标本，很多人感觉非常麻烦，需要收集24小时尿液标本，用测得的数值乘以每天的尿液总量，得出24小时尿液中总的11dhTxB2含量。否则，喝水多少都会影响尿液总量，造成结果偏差，这也是我们对尿液测定不感兴趣的主要原因。
      其实，在欧洲这个问题几年之前就得到了解决，方法也是很简单：在测定尿液11dhTxB2含量的同时，测定尿液肌酐数值，不需24小时收集或使用晨尿。最后数值表达方式为每毫克肌酐××皮克11dhTxB2。因为每天人体通过尿液排泄肌酐的量是固定的，尿液多，含量就低，尿液少，含量就高。通过和尿液肌酐的比值，完全消除了尿液多少不定造成的检测困扰。该试剂盒最后的CUTOFF值判定为每毫克肌酐1500皮克11dhTxB2。
      竞争性化验使用11dhTxB2 单克隆抗体检测两种主要的血栓素B2代谢物—11dhTxB2 和11dh2,3DTxB2，但未与其他TxB2代谢物或类荷尔蒙发生交叉反应 (表I)。11dh2，3DTxB2 形式与11dhTxB2相同，只是11dh2，3DTxB2的C端少两个碳。两种代谢物都来自于血小板，它们的形成都会受到阿司匹林的抑制。所以，Corgenix test kit 测定单克隆抗体的代谢物可有效的指示TxA2的循环水平。

表 I.检测血栓素B2 代谢物和类荷尔蒙时11dhTxB2 单克隆抗体特
征。PGEM 和PGFM 是前列腺素E和F的代谢物。
试剂盒的性能指标
      实验在AspirinWorks Test Kit 上进行，确定其分析性能。起始检测显示样本浓度为222pg/l时11dhTxB2的检测低限，线性检测范围是300-4000pg/ml。 测定的其他参数为干扰性，精密度，线性和稳定性。
      最开始的研究是确定干扰物的影响，如果高浓度某复合物对11dhTxB2测定有影响，可能会在经常服用阿司匹林的患者中发现。ASA及其代谢物水杨酸被认为存在于服用阿司匹林患者的尿液中。乙酰氨基酚是一种常用的消炎药。抗坏血酸维生素C是一种普遍的食品添加剂，咖啡因是日常消耗的咖啡、茶和软饮料的成分。葡萄糖和血色素在某些情况下可以在尿液中发现。检测11dhTxB2时，所有这些物质没有发现显著的干扰。(表II)。

表 II. AspirinWorks Test Kit的干扰物研究数据。在人类尿液样
本中检测服用阿司匹林者尿液中通常出现的复合物和代谢物，检
测浓度是否过高。测定的11dhTxB2 数值与质控进行比较。参考
质控，平均回归为105.9%。
      为了分析精密度，研究人员选择了三种尿液样本，分别是跨越检测范围的11dhTxB2的低值、中值和高值。他们将每个样本置入每批每板的多个孔内检测，获得的数值用于计算每个样本的均值、标准偏差、变化百分数。计算结果显示，在可报告的11dhTxB2数值范围内，多种批次之间测试间和测试内精密度高于15%。 (表III)

表 III. 不同板和批号的样本的AspirinWorks 精确度计算。
      样本也在一系列的稀释液中分析以确定测试的线性。5个不同的样本，每个进行四次独立的稀释因数(0.5, 0.2, 0.1, 和 0.05)稀释，每个稀释因数浓度也描绘出来(图2)。 R2 (符合度) 绘图数值范围0.9996—1.0，确定测试线性的样本稀释因数的变化范围0.5——0.05 (稀释比 1:2 至1:20)。

图2. 不同稀释下的样本数值的线性图。运行5个不同的尿液样本
用于线性研究。
      科研人员进行了11dhTxB2和试剂盒的稳定性研究。研究表明尿液中的11dhTxB2可以在室温或4℃ 保存两周, 经受4个冻融周期。此外，实时样本稳定性研究检查了一系列储存在-70℃的尿液标本。另外当样本储存1年及其以上时间时，11dhTxB2数值维持不变。最后进行试剂盒的实时稳定性评估。包被过的板和包装盒成分——包括盒内提供的三个不同的质控——储存在2-8℃时稳定期为12个月（图3）。3个11dhTxB2质控的平均数值是343、741、和1750pg/ml，变化百分数分别是12%、6%和5%。

图3. AspirinWorks kit 提供的三个11dhTxB2 质控在12个月内进
行检测，绘出的数值显示了试剂盒良好的稳定性。
阿司匹林治疗的影响
      研究使用的试剂盒是一个竞争性的ELISA，可以测定人类尿液中的11dhTxB2水平，确定阿司匹林对于个体的影响。为了检测这种能力，采用的171个尿液样本来自于三组人——未服用阿司匹林的；每天81mg阿司匹林，连续7天的；每天325mg，连续7天的。87个样本无阿司匹林，47个样本每日服用81mg，37个样本每日服用325mg，数值按照肌酐数值正常化。
      将这项研究的结果绘图（图4）。未使用阿司匹林的均值为每毫克肌酐3094 pg 11dhTxB2 ，每日服用81mg和325mg阿司匹林的分别为每毫克肌酐900 和 786 pg。 如上所示，在上述研究课题中未服用阿司匹林和其他两种的11dhTxB2都具有广阔的范围。

图4. 柱状图比较11dhTxB2 基线样本与服用阿司匹林的患者样本。
      圆柱表示25%到75%之间的数值， 每个圆柱内部的水平线表示本组的中值，点表示落在90%和10%界限之外的样本数值，用黑点来强调。
      这些范围进一步区分354个接受或未接受阿司匹林治疗的患者（267个样本来自每日服用81、162、325mg阿司匹林的患者，87个样本来自于未服用阿司匹林患者）。研究人员检测样本，计算11dhTxB2 浓度，换算成肌酐浓度数值，确定每个样本数值的频率。这项分析的结果显示，较高的数值来自于未服用阿司匹林的患者。（图5）

图5. 尿液11dhTxB2浓度数值的频率图：阿司匹林治疗与未使用阿
司匹林相比较。但是，一些阿司匹林使用者的样本也达到了每毫
克肌酐3900pg的浓度。这再次显示了个体之间对于阿司匹林反应
的差异，阿司匹林对于一部分人的治疗并不有效。
总结
      阿司匹林一直被认为是防止血栓形成的辅助处方药，但是它的药效在个体间有所差异，所以需要监测阿司匹林在特定患者身上的药效。目前检测阿司匹林药效的技术是体内血小板凝集方式，但是它对非环氧合酶路径的变量非常敏感，具有入侵性,需要专门的设备，这使它很难在同一时间运行大量样本，所以，临床需要非入侵的、精确的的方式来确定阿司匹林对接受其治疗的个体的影响。
      尿液11dhTxB2 是一种稳定的分子，也是测定TxA2循环水平的好方法。本文论述了由Corgenix及其合作伙伴开发的测试，对于一系列的尿液稀释液，回归浓度范围为300-4000pg/ml。这些性能显示这是一个对于个体患者检测阿司匹林有用的测试。关于加强测试的临床应用正在进一步研究中。