人表皮生长因子受体

老三

HER2基因与乳腺癌诊断、转移的关系
      有报告显示乳腺癌患者唾液中HER2含量较正常人高10倍以上，可用于早期乳腺癌的筛选性诊断。Mclntyre等进行的一项研究检测了40名正常女性,20名口服避孕药对照者的唾液，也发现HER2、CA15-3水平无明显差异，不受体内雌激素增高影响。其结果为检测乳腺癌提供了基础。还有研究发现，检测唾液中的可溶性HER2的稳定性、敏感性、特异性均提示其可作为乳腺癌早期检测的方法。研究发现，HER2的高表达可提高乳腺癌细胞的转移潜能，表现出较多的侵袭性临床病理特征。在
(20～30)%的侵袭性乳腺癌患者中HER2有扩增，HER2蛋白质的高表达出现在乳腺癌发生的早期阶段，腋淋巴结阴性的乳腺癌组织里HER2既没有扩增也没有高表达，腋淋巴结阳性或Ⅳ期乳腺癌组织中HER2的扩增或表达更高，提示HER2基因与乳腺癌细胞的转移有密切联系。
HER2的测定方法

      目前检测HER2基因的方法包括:免疫组织化学(IHC)法检测HER2蛋白过表达、荧光原位杂交(FISH) 法检测HER2基因扩增、显色原位杂交（CISH）检测HER2基因扩增、酶联免疫分析 (ELISA)、化学发光分析（CLIA）检测血清HER2 ECD或肿瘤组织P185以及聚合酶链反应（PCR）。ELISA和CLIA 法是唯一可实时检测HER2状态的方法,也是手术后检测HER2变化的唯一可行的方法。目前病理常规工作中最实用的方法是IHC、FISH和CISH。IHC较FISH节约成本、简单易行,但容易受到组织处理方法、固定时间等影响,其结果判断和解释存在较大的变异,而FISH 具有高度的重复性和可靠性。目前HER2的检测策略是通过IHC进行初筛,结果为弱阳性(++) 者再做FISH 加以确认, 此检测策略已在英国获得推荐。但目前尚没有一种方法可作为评估HER2的标准方法而被普遍接受。
免疫组织化学法
1. 定义
      用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。
2. 原理

      根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞标本或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
3. 分类
      1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
      2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
      3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。
4. IHC检测HER2结果判断

先在10×物镜下进行判读
注意细胞膜完全着色的癌细胞比例及着色强度
胞质着色应忽略不计
导管内癌(DCIS)的着色应忽略不计，只评定浸润癌的着色情况
正常乳腺上皮不应着色
应使用美国FDA批准的HercepTest评分系统
荧光原位杂交法
1. 定义
      荧光原位杂交法（FISH）是一种分子细胞遗传学技术，通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交。在荧光显微镜下，于细胞和(或)组织原位观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的多种彩色探针信号，以获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种基因状态的信息。荧光原位杂交技术问世于70年代后期，其曾多用于染色体异常的研究，近年来随着FISH所应用的探针钟类的不断增多，特别是全Cosmid探针及染色体原位抑制杂交技术的出现，使FISH技术不仅在细胞遗传学方面，而且还广泛应用于肿瘤学研究，如基因诊断基因定位等 。原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点，诸如每次检验均需重新标记探针，已标记的探针表现出明显的不稳定性，需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。在观察结果时，需要较多的分裂进行统计学分析。此外，由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面，可能引起计数上的误 差等。与之比FISH则具有①操作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年.②方法敏感,能迅速得到结果.③在同一标本上,可同时检测几种不同探针.④不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究,而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究。
2. 基本原理
      荧光原位杂交技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。如下图所示FISH检测人表皮生长因子受体-2（HER2）的原理图。

3. FISH检测HER2的结果判断

杂交信号计数
      应选择细胞核大小一致、核的边界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI)染色均一、细胞核孤立无重叠、绿色着丝粒信号清晰的细胞。
      随机计数20～30个癌细胞核中的双色信号。
      判读标准：红色信号的总数与绿色信号的总数比值≥2时，即为HER2基因扩增；若红、绿两信号的比值>20或众多信号连接成簇时可不计算，即视为基因扩增；若比值介于1.8～2.2之间，则需要再计数20个细胞核中的信号或由另外一个分析者重新计数，如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明；若HER2基因扩增在不同癌细胞中存在异质性时，应在另一癌区域再计算20～30个癌细胞核中的红、绿信号值，报告其最大值，并加以注释。注意避免G2期细胞内的基因拷贝数目特征(4个拷贝)可能导致的计数误差。
显色原位杂交法
1. 定义
      显色原位杂交（CISH）是使用标记的互补DNA或RNA 链来定位组织标本中特定 DNA 或 RNA 序列的过程。可以使用 CISH 方法来评价基因扩增、基因缺失、染色体易位和染色体数。
      2000年Tanner首次报道了采用CISH法检测HER2基因扩增的可行性，研究显示CISH与FISH具有极强的一致性，是一种可替代FISH对HER2基因扩增进行检测的切实可行的方法，可弥补IHC检测结果的不稳定性。随后大量研究均证实了CISH 与FISH 的检测结果具有高度的一致性(85％～100％)．且其在各实验室之间重复性良好，具有广泛的实际使用价值。
2． CISH的原理

      将癌基因探针用地高辛或生物素标记，利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的反应使在光学显微镜下检测石蜡组织mRNA的表达水平，适用于福尔马林固定、石蜡包埋的 (FFPE) 组织、血液或骨髓涂片、中期染色体涂片和固定细胞。
3. CISH检测HER2结果判断标准
      (1) 无扩增：大于50%的肿瘤细胞每个核内有1～5个信号点；
      (2) 低拷贝扩增：大于50%的肿瘤细胞核内有6～10个信号点；
      (3) 高拷贝扩增：大于50%的肿瘤细胞核内有多于10个信号点或者凝结成团块状、簇状信号颗粒；
      (4) 对于杂交信号在5～6个、难以判断的标本，应经FISH重新检测。
酶联免疫和化学发光法
      国外很多报告，HER2在正常个体的血液中存在，在乳癌转移妇女中浓度升高，在原发性乳腺癌检测中，HER2的阳性率约为20-30%，在乳腺癌转移病人中，大约80-90%的人群血液中的HER2浓度会升高，是非常好的检测乳腺癌转移的指标。而且，这也是目前可以连续监测且无创伤的唯一方法，值得国内大力推广使用。