血管内皮生长因子检测标本采集保存条件评价

孔雀明王

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是在胚胎发生和创伤愈合过程中启动血管形成的一个高度特异的有丝分裂原，也是一种有效的血管通透性诱导因子。VEGF是胱氨酸生长因子超家族的一员，主要由垂体中滤泡星形细胞产生，能诱导血管生成，其作用没有种属特异性。血管内皮细胞可作为检测VEGF促细胞增殖实验的靶细胞。外周皮肤组织受损后数小时，即可在损伤局部检测到VEGF mRNA和蛋白水平升高，这种VEGF水平的升高与损伤修复过程呈明显的时空相关性，当损伤局部完全修复后，VEGF水平可降低至正常。由于血管内皮细胞的过度增殖在许多种疾病的发病机制中可能具有重要作用，VEGF这种内皮细胞高度特异性生长因子，也因此而受到重视。实验室标本的收集与保存条件对检测结果有较大的影响，收集标本前必须清楚要检测的成分是否足够稳定。现就不同的标本收集与保存条件做实验对照，加以观察。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

    血管内皮细胞检测试剂盒由美国ADL（Adlitteram Diagnostic Laboratories,Inc）公司生产。

1.1.2 仪器

    Opsys MR酶标仪由深圳晶美生物工程有限公司(上海)生产；Opsys MW洗板机由深圳晶美生物工程有限公司(上海)生产；AMERICA 低温冷柜武汉产；YANGZI低温冰箱滁州产。

1.2 方法

1.2.1 实验原理

    用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，向包被抗VEGF抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗VEGF抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的VEGF呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

1.2.2 操作步骤

    按试剂说明书要求进行。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间后应尽快加入终止液，终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

1.2.3 检测方法

    取新鲜待测标本6份，分别检测其血清中血管内皮细胞生长因子含量，并将每份标本分别分成4份，使其中1份红细胞破坏溶血，成为溶血标本，检测溶血标本的VEGF含量。另3份分别置于2～8℃、-20℃、-70℃不同的保存环境中，于2 d、30 d，180 d分别检测VEGF的含量，记录OD值。

1.2.4 统计学方法

    统计学处理采用SPSS 13.0软件完成，两样本的比较采用t检验。

2 结果

    通过观察可见，标本在2～8℃环境条件下可保存2 d，-20℃条件下可保存30 d，-70℃条件下可保存180 d。溶血标本可使OD值显著增高，出现假阳性，因此在标本留取和保存过程中应避免溶血（见表1）。表1 不同条件下VEGF检验结果比较（略）

3 讨论

    研究表明，VEGF在动物机体生长发育中起着极其重要的作用［1,4］。VEGF的主要作用在于调节血管发生和血管形成，这主要体现在VEGF对血管内皮细胞的促进分裂增生和趋化作用。除此之外，VEGF对单核细胞也有趋化作用。目前研究认为［2］，血管发生过程对于肿瘤的生长和转移起着至关重要的作用。由于VEGF这种血管内皮细胞特异性生长因子在血管发生中起着重要的调节作用，因此，VEGF受体与肿瘤的生长和转移也存在着密切的关系。肿瘤组织内的血管内皮细胞表达VEGF受体明显高于正常内皮细胞，血管内皮生长因子及其受体的表达可作为患者预后的指标之一［3］。在急性心肌梗死患者，血清VEGF明显增高，比心绞痛和陈旧性心肌梗死者明显增高，表明血清VEGF浓度可反映心血管缺血程度［5］。此外，在一些血管发生异常过度的疾病，如糖尿病性视网膜病变及其他增生性视网膜病变、类风湿性关节炎、银屑病、接触性皮炎等病变组织局部也可检测到VEGF和VEGF受体mRNA水平升高。鉴于此，血管内皮生长因子检测越来越受到临床对疾病诊疗的重视，实验室标本的收集与保存条件对检测结果有较大的影响，收集标本前必须清楚要检测的成分是否稳定。从实验结果可知，标本在2～8℃环境条件下可保存2 d，-20℃条件下可保存30 d，-70℃条件下可保存180 d，溶血标本可使OD值显著增高，出现假阳性，因此在标本留取和保存过程中应避免造成溶血。对收集后当天进行检测的标本，可储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存，且应避免反复冻融，以期取得较好的检测结果。