金黄色葡萄球菌检测方法

山泉

一．材料与方法
1、材料
①培养基：7.5%NaCl肉汤培养基，血琼脂平板培养基（按常规方法制作）
②试剂：7.5%NaCl肉汤培养基，革兰氏染色，血琼脂平板，Baird-Parker琼脂平板，生理盐水，兔血浆（1：4），
③器材：温箱，显微镜，天平，均质器，载玻片，L型涂片棒，三角瓶，刻度吸管，平皿，试管及试管架，研磨，1ml注射器，
④实验动物：健康的小白鼠
2、方法
          待检样品25g+225ml 灭菌生理盐水
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　　　 直接计数法            增菌培养方法
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Baird-Parker琼脂平板      7.5%NaCl肉汤培养基
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              血平板                  血平板
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涂片染色镜  溶血观察　动物接种试验  血浆凝固试验
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                         报告
1、样品的采集
      称取25g火腿肠，切碎搅匀（用灭菌研钵研磨），置于250ml 锥形瓶中，加入225ml 灭菌生理盐水，制成1：10样品混悬液，混匀后作用20分钟，随机取10ml 离心。
2、增菌及分离培养
      ①增菌培养方法：吸取5ml上清液，接种于7.5%NaCl肉汤培养基内，置于（37±1℃）恒温箱中培养24h，划线接种入血平板，（37±1℃）恒温箱中培养24h。
      ②直接计数方法：吸取上述悬液，进行10倍递增稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液各1ml，分别加入3个Baird-Parker琼脂平板，每个平板的接种量分别为0.3ml、0.3ml、0.4ml。用灭菌L型涂布棒涂布整个平板，置于（37±1℃）恒温箱中培养24h。之后分别对3个平板上生长的周围有浑浊带的黑色菌落进行计数。转接入血平板，（37±1℃）恒温箱中培养24h。
3、涂片、染色与镜检
      将纯培养的未知菌涂片，革兰氏染色，显微镜观察。
4、生化实验
①触酶试验
      在载玻片上滴1滴3%的过氧化氢，调取纯化的细菌放在过氧化氢中观察变化。30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。
②血浆凝固酶试验
      吸取1：4新鲜兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入培养24h的2①中的肉汤培养液0.5ml，摇荡均匀，放入（37±1℃）恒温箱中培养，每0.5h观察一次，观察6h，检查是否出现凝固。将试管倾斜或倒置时，呈现凝块状，可判定为阳性，同时以已知阳性葡糖球菌和阴性肉汤作为对照。
5、动物感染实验
      用无菌生理盐水将2①中血琼脂板上纯化的菌落洗下后，以0.5ml/只腹腔注射入小白鼠体内，同时用灭菌生理盐水注射入另外的小白鼠体内，以做对照，分别在相同条件饲养，观察其症状。对感染试验出现症状或死亡的小白鼠进行剖检，并采集病料，进行分离。
二．结果与分析
1、培养特性及形态特征
①培养特性
      在37℃条件下，需氧与厌氧培养的血液营养琼脂平板均长出光滑、湿润、隆起，约1mm大小的金黄色菌落，并且有β溶血现象。
②镜检结果
      显微镜下观察该菌为革兰氏阳性球菌，排列成葡萄串状，也有个别2个或3个球菌相连。根据菌落形态、镜检结果怀疑该菌为葡萄球菌。
2、菌落计数报告
      将直接计数法试验中的3个平板中疑似黑色葡萄球菌的金黄色菌落数相加，乘以血浆凝固酶试验阳性数，除以5，在乘以稀释倍数，即为每克样品中金黄色葡萄球菌数量。
3、动物感染试验
      只注生理盐水的小白鼠没有任何变化：接种分离菌的小白鼠在9h内死亡。将死亡的小白鼠剖检采集病料，进行细菌分离和生化试验，得到与原分离菌。