头孢哌酮·舒巴坦药敏纸片中舒巴坦量对药敏结果的影响

晨曦

   
【摘要】目的探讨头孢哌酮一舒巴坦药敏纸片中舒巴坦量对药敏结果的影响。方法用琼脂稀释法检测头孢哌酮、头孢哌酮一舒巴坦(2:1)和头孢哌酮．舒巴坦(1:1)3组药对临床分离的534株革兰阴性杆菌的MIc值；用纸片扩散法检测头孢哌酮、头孢哌酮.舒巴坦75/30μg和75/75μg3种纸片对此534株菌的抑菌环直径；分析MIC结果之间，纸片扩散法之间，以及2种药敏方法之间的结果是否有差异。结果经琼脂稀释法检测头孢哌酮、头孢哌酮.舒巴坦(2:1)和(1:1)MIC卯分别为：32、16、16μg/ml，MIC90分别为≥256，128，64μg/ml，Wikoxon秩和检验两种药量配比MIc结果无统计学差异(z=一O.248，P=0.804)；头孢哌酮-舒巴坦75/30μg药敏纸片(75/30纸片)检测的敏感率(s％)、耐药率(R％)和中介率(I％)分别为55.3％、24.5％和20.2％，与琼脂稀释法结果相似。头孢哌酮．舒巴坦75/75μg(75/75纸片)敏感率、耐药率和中介率分别为72.5％、12.4％和15.1％，比75/30纸片检测的总敏感率高17.2％，对75/30纸片及75/75纸片测所有菌株的2组抑菌环直径进行配对t检验(t=21.613，P<O.01)，但这种差异只来自于cIsI规定检测出的产ESBL菌株、鲍曼不动杆菌和未经EsBL检测的其他肠杆菌科菌株；而对铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和EsBL阴性菌株的敏感率或耐药率差异无统计学意义。结论头孢哌酮．舒巴坦(2:1)和(1:1)琼脂稀释法药敏结果及75/30μg纸片法药敏结果无差异。当使用75/75μg药敏纸片报告产ESBL菌株、鲍曼不动杆菌和其他肠杆菌科菌株的药敏结果时，应注明舒巴坦的含量。
【关键词】头孢哌酮；舒巴坦；纸片扩散抗菌试验；微生物敏感性试验
      近年来，由于超广谱β内酰胺酶产生，临床使用β内酰胺类酶抑制剂的复方药增多，头孢哌酮一舒巴坦是常用复方药之一。目前，注射药头孢哌酮．舒巴坦两种成分的配比有2000/l000mg/瓶，l000/500mg/瓶和500/500mg/瓶，750/750mg/瓶；我国药敏试验纸片扩散法使用的纸片有2种：头孢哌酮一舒巴坦75/30μg和75/75μg，它们可能和临床治疗用药量配比不同。注射复方药头孢哌酮一舒巴坦药物剂型和药敏纸片的2种成分配比都有2：l和l：l，在临床检验工作中用哪种药敏纸片更能支持临床合理用药，给临床医生和微生物实验室人员造成困惑。本研究旨在探讨这2种纸片对体外药敏报告的影响。
材料与方法
一、材料
      1．菌种来源：收集2005年1月至2008年4月北京地区临床不同来源(血液、痰、尿及体液)的革兰阴性杆菌共534株，其中产ESBL大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌173株，不产ESBL8l株；其他肠杆菌科5个属共60株，包括肠杆菌属2l株，费劳地柠檬酸杆菌8株，摩根摩根菌6株，黏质沙雷菌11株，产酸克雷伯菌14株；非发酵菌220株，包括鲍曼不动杆菌88株，铜绿假单胞菌69株，嗜麦芽窄食单胞菌63株。本次研究用菌株经Vitek或API鉴定确认。
      2．药物标准品：头孢哌酮(cefoperazone sodium，CPz)，批号：08356018，生物活性相当于93lμg/ml纯品；舒巴坦(sulbactam sodium，SBT)，批号：08391030，生物活性相当于90.3％纯品；均来自美国Pfzer药厂，试验期间所有标准品均在有效期内。
      3．药敏纸片：头孢哌酮(755μg/片)，批号：550094，头孢哌酮一舒巴坦(75/30μg/片)，批号：658301头孢哌酮．舒巴坦(75/75彬片)，批号：560248，均来自英国Oxoid公司。试验期间所有药敏纸片均在有效期内。
      4．培养基：MH肉汤来自英国Oxoid公司，MH琼脂来自法国biomerieux公司。
      5．仪器：多点接种仪(英国Boekel scientific公司)。
二、方法
      1.药敏试验参考方法：采用琼脂稀释法检测所有菌株MIC值，依据CLSI需氧菌琼脂稀释法药敏方法（M7-A7，2006）；参考Barry等文献，头孢哌酮-舒巴坦的判定折点与头孢哌酮单药相同，MIC≥64μg/ml为耐药，≤16μg/ml为敏感。
      2.纸片扩散法药敏试验：采用纸片扩散法（K-B法）检测所有菌株抑菌环直径，依据CLSI需氧菌纸片扩散药敏法（M2-A9，2006）标准；2种方法药敏结果解释依据CLSI（M100-S18，2008）标准；纸片扩散法≤15mm为耐药，≥21mm为敏感。
      3.统计学分析：统计软件使用SPSS16.0。2种药量配比的药物MIC值比较用Wilcoxon符号秩和检验；比较2种药量配比的纸片抑菌环直径差异用配对样本t检验（双尾）；P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
      1. 质控结果：依据CLSI琼脂稀释法检测MIC，纸片扩散法检测抑菌环直径，每批试验均设用质控菌株，质控结果见表1。参照Barry等方法，大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853对头孢哌酮-舒巴坦的质控范围与头孢哌酮相同。全部质控结果在CLSI标准M100-S18可接受质控范围内。

      2. MIC值分布：用琼脂稀释法检测舒巴坦、头胞哌酮、头孢哌酮-舒巴坦（2：1）和头孢哌酮-舒巴坦（1：1）MIC值，2：1药物从256/128μg/ml、1：1药物从256/256μg/ml起始作对倍稀释至0.125/0.06和0.125/0.125μg/ml，MIC结果均以头孢哌酮浓度表示。MIC值分布、累积率、MIC范围、MIC50和MIC90结果见表2及图1。
      表2结果显示，头孢哌酮MIC50为32μg/ml，头孢哌酮-舒巴坦2：1及1：1两种药量配比MIC50均为16μg/ml。头孢哌酮-舒巴坦2：1及头孢哌酮-舒巴坦1：1两种药量配比MIC90分别为128μg/ml及64μg/ml。Wilcoxon秩和检验比较两种药量配比药物MIC浓度差异：头孢哌酮-舒巴坦2：1与头孢哌酮-舒巴坦1：1对534株临床分离革兰阴性杆菌MIC结果经Wilcoxon秩和检验，差异无统计学意义（Z=-0.248，P=0.804）与文献报道一致。

     3. 纸片法检测结果： 头孢哌酮- 舒巴坦两种纸片含量配比（75/30μg/片及75/75μg/片）对534株革兰阴性杆菌的抑菌环直径的累积率图（图2，表3）。表3结果显示：
（1）纸片法检测头孢哌酮敏感率、耐药率和中介率与稀释法结果相似；
（2）稀释法检测头孢哌酮加舒巴坦酶抑制剂后敏感率增加，头孢哌酮-舒巴坦（1：1）检测的敏感率为58. 8%，头孢哌酮-舒巴坦（2：1）检测的敏感率为50 . 6%，差异无统计学意义（X2=3.714，P=0.067）；
（3）75/30μg纸片检测S%、1%、R%与稀释法的头孢哌酮-舒巴坦（2：1）和头孢哌酮-舒巴坦（1：1）的结果相近，而75/75μg纸片检测的S%等于72.5%、R%等于12.4%，75/30μg纸片检测的S%等于55.3%、R%等于24.5%。二者的累积曲线有明显不同（图2）。
                  
                注：↑=16μg/ml为S折点；↑=64μg/ml为R折点；头孢哌酮-舒
              巴坦2：1与头孢哌酮-舒巴坦1：12种配比浓度的S%和R%无差异
              图1琼脂稀释法测4种药物对534株革兰阴性杆菌的MIC值累积曲线
      4. 2种配比纸片抑菌环直径差异比较：对534株受试菌两组抑菌环直径进行配对t检验（表4），对于不同分组菌株，头孢哌酮-舒巴坦75/30μg纸片抑菌环直径均小于75/75μg纸片结果，2种配比药敏纸片抑菌环直径差异有统计学意义。其中ESBL阳性菌和鲍曼不动杆菌2种纸片抑菌环直径比其他类菌株差异更大。

                  
                  注：↑=21为S折点；↑=15为R折点；75/30μg/片S%=55.3%、
                  R%=24.5%，75/75μg/片S%=72.5%、R%=12.4%
               图2 纸片扩散法测头孢哌酮-舒巴坦75/75μg/片及75/30μg/片对
                     534株革兰阴性杆菌的抑菌环植累积曲线

      虽然ESBL阴性菌75/30μg和75/75μg纸片抑菌环直径的均值分别为26.41和27.19mm、嗜麦芽窄食单胞菌为26.54和27.24mm，但都在敏感范围内；铜绿假单胞菌为19.09和20.00mm，都在中介范围。而ESBL阳性菌、鲍曼不动杆菌和其他肠杆菌科菌75/75μg纸片抑菌环直径的均值落在敏感范围，分别为23.03、24.12和21.86mm，75/30μg纸片抑菌环直径的均值落在中介度范围，分别为18.47、19.27和20.66mm，造成75/75μg纸片75/30μg纸片检验结果敏感率高，75/30μg纸片75/75μg纸片检验结果耐药率高的现象（表5）。

      5.纸片扩散法结果与MIC结果相关性：纸片法检测头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦两种药量配比药物抑菌环直径与稀释法MIC结果分别得出回归方程（表6），头孢哌酮和75/30μg纸片检测结果与MIC结果一致率相近，分别为82.5%和82.9%；75/75μg纸片与MIC结果一致率稍低，为77.8%，与文献报道非常相似。

      误差率统计结果显示（表6），非常重大错误率（假敏感率）头孢哌酮和75/30μg纸片结果均为0.9%，75/75μg纸片结果略高，为2.2%，与文献报道相似。重大错误率（假耐药率）头孢哌酮较高为6.5%，75/30μg为0.7%，75/75μg纸片法结果为0.2%；而小错误率（一个方法报告中介度，而另一方法报告敏感或耐药）从低到高依次为：头孢哌酮为10.1%，75/30μg纸片为15.5%，75/75μg纸片法为19.8%。
讨 论
      目前临床大量使用的头孢哌酮-舒巴坦注射液有2000/1000mg/瓶、1000/500mg/瓶等和500/500mg/瓶，750/750mg/瓶等配比。我国临床微生物实验室所用商业化药敏纸片现有75/30μg/片和75/75μg/片2种，后者将每片中舒巴坦含量加大了1倍。这两种纸片检测出的抑菌环直径差异是否有统计学意义，对临床报告和治疗是否有影响，应该得到实验室的关注。由于纸片扩散法是从定量的参考方法稀释法推导而来，当纸片法抑菌环直径与稀释法MIC值的对数呈线性相关，才可能制定纸片法的折点。
      对2种舒巴坦含量药敏纸片534株菌的抑菌环直径进行配对t检验，显示两者间有统计学差异，因菌株类别不同，对药敏结果的影响也不尽相同，说明ESBL阳性菌和鲍曼不动杆菌是造成两种纸片判定差异的主要菌属，可能是由于复方纸片中舒巴坦的加量加强了对ESBL的抑制作用，舒巴坦还对鲍曼不动杆菌有直接抑制作用。
      本研究结果显示，头孢哌酮-舒巴坦（2：1）和（1：1）的琼脂稀释法结果与头孢哌酮-舒巴坦75/30μg纸片法结果可在药敏报告和耐药监测数据中通用；当使用75/75μg纸片检测ESBL阳性菌和鲍曼不动杆菌及未经ESBL检测的其他肠杆菌科菌株时，药敏、敏感率或耐药率结果的报告应注明使用纸片的舒巴坦含量。
      由于舒巴坦对产不同类型酶的鲍曼不动杆菌抑菌效果不同，ESBL也有很多基因型，头孢哌酮-舒巴坦药敏纸片中舒巴坦量对这两类菌的药敏结果影响还有待进一步探讨。