沙眼衣原体感染的实验室诊断—筛查（EIA）与确认（DFA）

姑姑机

沙眼衣原体(chlamydia trachomatis，CT)是近年来最常见的性传播疾病病原体之一，男性和女性均可感染，并可导致严重的后遗症，如女性宫外孕、输卵管性不孕以及男性不育等。生殖道沙眼衣原体感染是人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的协同因素。最新研究报道它还是罹患宫颈癌的危险因素。
一、沙眼衣原体的流行概况
      据统计，美国每年大约有400万新感染病例，整个欧洲的新感染病例数已达到每年1000万，全球每年检出的新感染沙眼衣原体病例数约为8900万。由Parish等人于1999～2000年在中国所做的一项流行病学研究显示，一般女性生殖道CT感染率为2．6％ ，一般男性生殖道CT感染率为2．1％；而北京大学第一医院妇产科的研究显示，北京地区正常妇女宫颈衣原体的感染率高达13．4％。美国每年用于治疗沙眼衣原体感染及其并发症的费用约3O亿～4O亿美元。在英国，每年用于治疗此病的成本至少是5000万英镑。由于50%男性和75%女性感染后表现为无症状感染，故绝大多数感染者是通过筛查发现。生殖道沙眼衣原体感染会造成严重的经济负担，大部分费用是治疗女性感染者，尤其是有后遗症的女性，主要是慢性盆腔疾病。据估计治疗女性感染者的费用占治疗衣原体感染总费用的80％。
二、沙眼衣原体筛查的必要性和可行性
      生殖道沙眼衣原体感染的筛查是用实验室诊断试验对有筛查指征的人群进行检测，尽早发现感染者或无症状感染者，及
时给予确诊和处理，以控制进一步的传播，减少发生后遗症的可能性。
      通常约有1／2～1／3的沙眼衣原体感染者无任何自觉症状，如果得不到有效的洽疗，感染可持续1年甚至数年。在此期间可发生盆腔炎和输卵管狭窄等并发症。此外，无症状的感染者可作为传染源将病原体传染给性伴侣。沙眼衣原体感染的高流行率和众多严重的并发症可带来高额治疗成本，从而使它成为严重的公共卫生问题。但该病自然史清楚，可以通过早期诊断和用有效治疗药物治愈。因此，在人群中，尤其是在无症状的性活跃期妇女中，开展沙眼衣原体筛查具有可行性和必要性。早在60年代欧美等发达国家就已经将沙眼衣原体作为一种独立的性传播疾病开展筛查和监测。我国卫生部于2007年颁布《全国性病监测点监测方案》，新增加了生殖道CT感染作为单独监测的病种。
三、筛查人群和指征：
      筛查人群主要是针对高危人群，由于不同国家不同文化背景的差异，危险因素也会改变。美国预防服务特别工作组于2007年7月发表了衣原体感染筛查指南(Ann Intern Med，2007，147：128)。该指南需要进行沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)筛查的人群：(1)未孕妇女：年龄<24岁且有性能力；>25岁、有性能力、而且处于STDs危险(即有衣原体感染史或其他性传播疾病史、有新的或多个性伴侣、未坚持采取防护措施的职业性工作者)。(2)孕妇：年龄<24岁；年龄>25岁且患STDs风险较大。(3)男性：因证据不足而未给出建议，尽管其沙眼衣原体感染率与女性相似。但通过考察后发现，尽管对男性进行衣原体感染的筛查和治疗所获得的直接效益相对较小，但女性却可从中受益，因此考虑到其社会效益可能会对该条建议进行修正。
      研究发现，在STD门诊、计划生育门诊、流产门诊和青少年健康门诊，沙眼衣原体的感染率在10％～12％，高于不育门诊，这与到不育门诊就诊者年龄偏大有关。在上述感染率较高的门诊可选择普遍性筛查，即对所有的女性或男性就诊者都进行筛查。而对不育门诊等感染率较低场所使用选择性筛查，即针对有危险因素的女性进行筛查。
四、沙眼衣原体的筛查和确认方法
      生殖道沙眼衣原体的特异性检查试验有3类方法：①细胞培养；②抗原检测，如直接免疫荧光法、酶免疫测定(EIA)、快速免疫层析法等；③核酸检测，包括核酸探针法和DNA／RNA扩增。目前没有任何一种方法可以避免假阳性或假阴性结果的出现。无论我们在采样、处理上怎样仔细小心，无论我们在检测方法和设备上如何改进，无论我们对一份样本进行多少种不同方法的检测，我们都只能接近真实的结果。假阳性和假阴性是必定存在的，但我们可以想办法减少它。为了对患者负责，避免患
者不必要的经济和心理负担，避免抗生素的滥用，美国CDC推荐所有除细胞培养法之外的试验阳性结果都要用其他检测方法
作确认试验。因此，在国外衣原体的实验室诊断分为筛查和确认两部分。目前国外使用的衣原体筛查方法主要有EIA法（占90%以上）和快速金标法（10%）。衣原体确认实验方法有DNA扩增实验（包括PCR）、DFA实验、IFA实验和培养法。
      1．沙眼衣原体筛查方法的比较（ 主要进行成本效应分析）
      EIA用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测CT的LPS或MOMP，酶反应生成有色产物，用酶标仪进行测定。EIA的优点在于方法简便、操作自动化，适于短时内大批量标本的检测，结果判断客观性强；缺点在于试验结果阴性时，不能完全排除CT感染；在低流行率人群中应用时，解释结果宜慎重。胶体金抗原快速检测利用CT属特异性脂多糖抗原单克隆抗体的测定来检测CT。其优点是操作简便、快速，无需复杂的仪器设备，可单人份操作，但是标本中需要足够数量的沙眼衣原体抗原，否则可能出现漏检；敏感性较低，不宜质控操作。
      如果采用国际上公认的DFA＋PCR实验确证，以筛查有症状女性患者的宫颈拭子样本为例，快速法与EIA法相比不具有优势（见表4），而国外快速法仅用于急需试验结果的急诊有症状的病人和不具备试验条件的小型门诊。







      从表1中可以看出，虽然快速法表面看来具有诊断时间短，成本低廉的优势，但是医生为获取准确的诊断结果需要付出更多的成本和耐心。而不求准确结果的诊断是极不科学的。国内李启宁对金标快速免疫试剂盒检测沙眼衣原体的性能作过评估，结果显示：以Dako酶免法结果为参照，两种金标法对男性标本的敏感性分别为“英国立明”58.33%“美国思创”66.67%；对女性患者的敏感性分别为“ 英国立明”85.29%，“美国思创”82.35%，其敏感性均较低，尤其是对男性尿道拭子标本的漏检率较高。
      2．采用IFA和PCR相互确认的方法和有症状女性患者宫颈拭子样本进行实验比较（见表2）。

      如表2所示，培养法是沙眼衣原体诊断的“金标准”，目前仍然是国际上刑事案件中唯一的法定诊断方法。但是培养法需要很长时间才能得到结果，不适应临床诊断需要。而且培养法的相对敏感度并不高，同时对试验条件和技术要求也很高，因此也不适于推广。
      DFA方法是目前已知特异较高的沙眼衣原体诊断方法，它可以在显著缩短诊断时间的同时极大的提高实验敏感度，同时对试验的要求也稍有降低。DFA操作简便、费用低廉，不象培养法必须存在有活力的CT，多数学者报道其特异性较高，Hallsworth等报道可达100%，因此是目前国外，尤其是美国应用最广的衣原体确证试验。
      核酸扩增技术是一类体外扩增沙眼衣原体特异DNA的检测方法，这些技术包括（1）靶DNA或RNA的扩增，如聚合酶链反应(PCR)，基于转录的扩增(TBA)，自动维持序列扩增(3SR) 以及链置换扩增(SDA)；（2）探针扩增，如连接酶链反应(LCR)，Q-β复制酶的扩增；（3）杂交后信号的扩增，如复合探针和分支DNA探针。其中研究和使用较多的是PCR和LCR，尤其是PCR技术。这些方法比直接免疫荧光染色和酶免疫法敏感和特异。但核酸扩增试验的敏感性还存在一些问题，包括临床标本中的激素、血红蛋白、有机盐、免疫球蛋白和细胞代谢的其他产物的抑制，以及在提取时核酸的丢失、Taq酶失活、退火温度不对、Mg++浓度不佳、扩增仪孔的热传导性是否均一等因素均可导致假阴性结果。另外，由于其本身技术原理的原因，容易造成假阳性污染，在实际工作中，常见有以下几种污染类型：扩增片段的污染(产物污染)；天然基因组DNA的污染、试剂污
染(贮存液或工作液)以及标本间交叉污染(如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本阴性的标本)。临床基因扩增检验实验室中污染的最主要来源是扩增产物的污染。一旦发生污染，再围绕实验室来寻找污染源不仅耗时而且还很繁琐，如果发生了污染，实验就必须停止，直到发现了污染源为止，并且实验结果必须作废。核酸扩增技术的使用有严格规范的实验室要求，一般的实验室和技术人员不容易掌握，尤其国内PCR大热和技术人员严重缺乏的情况下国家甚至为它设立了专门的前置性审批。并且由于PCR需要的设备和试验条件非常苛刻，费用也相当昂贵，在国内目前还不易大面积推广。
五、迈康准TM衣原体抗原试剂的优势
（1）灵敏度和特异度高
      目前市场上衣原体EIA检测的主要产品有：迈康准（Micro Trak II）、雅培（Abbott）、Dako、Medac、Savyon、Medac、Labsystesm等，国内主要为Dako和雅培。它们之间的比较见表3和表4。
     


       广东省皮肤性病防治中心分别于2004年和2007年对迈康准 EIA进行过试剂评估。在2004年的评估中，共检测了164例标本，采用细胞培养法作为“金标准”方法，PCR为辅助标准，结果见表5。
      2007年分别采用迈康准 EIA和迈康准DFA检测泌尿生殖道CT，两法结果不一致时采用荧光定量PCR确证，共检测222份女性宫颈拭子和69份男性尿道拭子，结果见表6。
                        
      V. J. Chalker等回顾分析了2002年1月至2004年6月UK NEQAS对衣原体检测的室间质评情况，包括英国、澳大利亚、意
大利等18个国家的295个实验室参加。下发的8份阴性标本中，共回报了2010个结果，其中有20个是阳性结果，分别是：
EIA：Unipath Clearview Chlamydia [n= 4],
bioMe’rieux VIDAS [n=4],
Murex Diagnostics [n=1],
Dako IDIEA [n=1],
Launch Diagnostics Phadebact Chlamydia
EIA [n=3]
NAAT：Abbott LCx [n=1],
BD ProbeTecET [n=3],
Gen-ProbeAMP-CT [n=1],
Roche AMPLICOR CT/NG [n=2].
      参评的MicroTrak Chlamydia EIA 无1例假阳性。
      在一项评估不同试剂对纯化的衣原体原体的敏感性实验中，KUIPERS等人发现：MicroTrak DFA对尿液中的原体的敏感性是2～3×103个原体/ml尿液，而IDEIA 和 PACE2 的敏感性仅为2～3×104个原体/ml尿液；对分泌液的敏感性分别是：MicroTrak DFA为 2～3×105个原体/ml分泌液，Chlamydia EIA 为2～3×106个原体/ml分泌液。由此可知，迈康准试剂（MicroTrak DFA）的敏感性也高于IDEIA和 Chlamydia EIA。
（2）阳性检出率高
      在欧美等发达国家，随着性教育的普及和大面积衣原体筛查的普遍化和常规化，衣原体感染的比例经历了七、八十年代的快速上升后逐渐稳定在1％～5%。在我国，随着性观念的开放、首次性经验年龄的下降和性教育的严重滞后，衣原体感染人数直线上升。到2000年为止，估计感染人数已经超过10%。因此，选择高敏感性和特异性的检测方法有重要的意义。广东省佛山市皮肤病防治所用Microtrak lI EIA酶免法对自2004年4月～2005年l2月收集的4089份男性尿道拭子和女性宫颈标本进行了沙眼衣原体抗原检测，总阳性检出率14.09％ ，其中男女性分别为15.66％和9.57％,这与目前的流行病学研究结果是相符的。
（3）配套采样拭子的洗脱率高
      取样的质量对衣原体检测极为重要。衣原体的检测质量有赖于准确的样品收集技术和高质量的取样拭子。目前市场上有各种不同的拭子可用，但是不同材质的拭子在取样后对样品的洗脱率大不一样，而洗脱率的高低又决定了能否得到足够的样本，从而避免假阴性的出现。
      为保证试验品质和方便大样本量筛查实验，我公司免费赠送原装进口的配套采样盒，内有采样拭子、清洁拭子和采样管各
一支。该采样拭子由特殊材质制造，造型纤细，既能减少患者对取样的不适感，又有极高的样品洗脱率，从而提高了检测的
阳性率，得到了检验科和临床科室医生的一致认同。
六、如何开展衣原体筛查和确认试验
      国外医院或独立实验室都依据自身条件和患者承受能力设置相应的衣原体筛查诊断方案。大型医院和独立实验室一般采用
EIA抗原法筛查，DFA或+PCR进行确证；中小型医院一般将样本送到大型医院和独立实验室检验；开展急诊的诊所一般先用DFA或快速法筛查，患者稳定后再采样进行确认。迈康准TM(MicroTrak)衣原体ELISA抗原诊断方法以其相对较高的敏感度和特异性，低廉的筛查成本和适应大规模筛查等优势在欧美等国家的衣原体筛查领域连续十多年占据领军地位。根据现阶段我国的国情，采用合适的筛查和确认方法，从而用较少的费用，取得最大的成效，我们建议采用如下筛查方案：
                                    
      国外使用迈康准TM(MicroTrak)衣原体免疫试剂一般使用cutoff+0.20，并根据当地的流行率设一个10～5O%的灰带，可提高检测的敏感性，减少漏检。由于国外衣原体流行率比较低，其灰区设置一般为5O%。在中国，由于感染率超过10%，如果按照试剂盒提供的临界值设置方法(cutoff +0.20)，则有一定的漏检率。根据珠海市慢性病防治所徐刚的研究，使用迈康准TM衣原体免疫试剂检测时，设置25%的灰区可以明显提高实验的敏感度，而工作量和成本增加不明显。
      迈康准衣原体酶免试剂盒用于大量样本的衣原体筛查，产品源于爱尔兰TRINITY公司。该产品经美国FDA、中国SFDA和欧盟CE认证，有占美国衣原体筛查市场份额的90％，新西兰的95％，欧洲的70％！广州康润生物制品有限公司为该产品在中国的总代理，为保证试验品质和方便大样本量筛查实验，我公司配送原装进口高品质的采样管，配置专用全自动酶免分析仪。配套的仪器一次最多可处理95份标本，技术人员只要将试剂和处理好的标本放入仪器，整个实验过程、结果计算、出检验报告一切都由机器自动完成。这从最大程度上减少了人为操作误差，增加了试验结果的可信度。