自动白细胞分类计数的技术现状和展望

大山

胡晓波，上海交通大学医学院附属第三人民医院检验科主任，副主任技师。1993年毕业于上海第二医科大学，并留校任医学检验系教师。1999年至上海市临床检验中心，担任中心副主任，负责业务和部分行政管理工作。2006年至上海交通大学医学院附属第三人民医院检验科工作，担任科副主任、主任，负责业务和部分行政管理工作。研究方向：临床检验基础的临床实践和质量管理。发表论文几十篇，参编和主编书籍几十本。任中华医学会检验分会血液体液学组委员，医学实验室认可评审员，《检验医学》、《中国实验诊断学》、《诊断学理论与实践杂志》编委。

      随着细胞计数技术实现自动化后，1970年代对白细胞分类计数的自动化需求也随之增加，先后有两种不同的技术被引入该领域，其一为基于显微镜的自动方法，采用自动影像分析技术直接识别和分析染色的血涂片上白细胞；其二为所谓流式系统（flow system），基于自动细胞计数的原理，对白细胞做特殊染色后进行分类计数。
一、自动白细胞分类计数历史
      最早实现细胞分类自动化的是影像处理技术。1952年，建立巴氏染色（Pap stain）技术的Papanicolaou开始着手研究自动宫颈涂片筛查仪。他和Mellors发现，单位面积下癌细胞发出的荧光常超出正常细胞，基于此，他们制造了一台光电扫描仪，用于自动测定核荧光信号。但是，采用单一参数不能很好鉴别宫颈癌细胞，因此该仪器未能得到推广研究。1950年代末到1960年代初，美国国立癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）资助了细胞学分析仪项目，以期实现宫颈涂片异常细胞的自动筛检，是对宫颈涂片扫描后，测量细胞核大小和核密度两个参数，然后进行分类。但是，该仪器不能判断密度大的区域是宫颈癌细胞的核，还是成堆的白细胞和其他成堆的细胞。
      在1960年末到1970年初，Ingram、Preston、Young和Bacus等分别开始研究影像法白细胞自动分类。1973年，按法则规定需将正常白细胞至少分成6类，包括中性粒细胞分叶核和杆状核、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。因快速、常规和可靠的需求，自动白细胞分类仪开始进入临床检验领域。1972年，Larc首先在国际血液学大会上报道了应用康宁玻璃制作的自动白细胞分类计数仪。1974年Geometric Data公司和Coulter公司，1978年Abbott公司分别制造了基于影像技术的Hematrak、Diff-3和ADC 500仪器。尽管这些仪器可用于成熟白细胞的亚分类，并能提供红细胞形态学定性参数信息和异常有核细胞的信息。但是，这些自动白细胞分类仪价格昂贵，缺点不少，未能在临床广泛使用。
      随着多参数细胞计数仪在临床上常规使用，一方面，实现了自动进样到结果自动报告的全自动化，无需显微镜计数细胞；另一方面，昂贵的影像处理仪仅实现了染色血涂片的自动化显微镜检查过程，相对处理速度较慢，多数血涂片仍需形态学专家的进一步帮助。基于当时计算机速度和技术的局限性，自动化白细胞分类系统仍有许多缺陷，如血涂片制作和染色仍需手工操作、实验室信息系统不完善，结果必须手工录入。近年，因计算机硬件和软件的飞速发展，自动影像处理系统再次引起了人们的兴趣，采用神经网络技术，大大提高了人工智能识别能力，如CellaVison系统。
      与自动影像处理系统平行发展的另一种自动白细胞分类方法，是基于酶细胞化学的方法，在光学法在细胞计数时能自动分类白细胞。该法首先由Technicon和Mount Sinai医学院合作建立。1974年，Mount Sinai医学院的Ornstein和Ansley建立并报道了应用连续流动技术，使用细胞化学染色法对白细胞进行分类计数。第一代自动白细胞分类仪是1974年Technicon的Hemalog-D，该系统采用3个平行通道对白细胞进行分类，其中，第1通道，用4-氯-1-萘酚染色含髓过氧化物酶的细胞，按细胞染色和大小，将白细胞分为淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞；第2通道，在特定pH条件下，用非特异性酯酶对细胞进行染色，以识别单核细胞；第3通道，采用Alcian蓝染色，对嗜碱性粒细胞进行分类。Hemalog-D系统已实现了自动化分析和处理白细胞的能力，在每个通道中计数10000白细胞，并进行分类，计数结果具有高精密度。
      与自动影像分析技术类似，流式分析系统也有局限性。虽然，这类仪器在很大程度上实现了自动化，但是，其优点也并非能胜过价格，许多标本仍需进一步显微镜检查以识别红细胞形态和异常细胞形态，而且采用连续流动技术的设备必须定期校准。
      Technicon将Hemalog-D和Hemalog-8两个系统合并，形成了第一代的多参数血细胞分析系统（multiparameter cell counting system）。随后，具有相似特点的多种血液分析仪也很快问世。如1989年Coulter公司的STKS分析仪，1991年较小型的MAXM分析仪；1989年Sysmex公司的NE-800系统，采用3个独立通道进行白细胞分类计数；1980年年代末期的Abbott公司的CellDyn系列多参数分析仪，采用偏振光进行白细胞分类计数；1990年代早期Horiba ABX公司的多参数系统也面世使用。
二、自动白细胞分类技术进展
1.自动显微镜法
      手工白细胞分类计数的主要缺点是效率低下。在2000年左右，新一代自动显微镜分析仪出现（如CellaVision DM8和DM96)，大大提高了白细胞分类的速度和精度。在涂片制作和染色实现自动化后，这些称为自动数字化细胞形态学系统（automated digital cell morphology systems），能准确定位和数字化细胞，并按软件设计预分类细胞，将数据贮存在扩展数据库中。与CLSI推荐的操作方法相比，仪器的涂片读取速率是35张/h，还能同时对红细胞和血小板的形态进行分析。与形态学术语比较，将白细胞预分类为中性分叶核粒细胞、中性杆状核粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、原始细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、异形淋巴细胞、浆细胞和未分类细胞。近年研究表明，对于正常白细胞亚群，DM96预分类结果与手工法相关性良好；对于异常亚群白细胞，相关性不好，需要进一步手工分类，多数用户认为自动化方法具有较高的效率。尽管自动化形态学分析仪具有高效率，但所有异常的结果仍需重新进行手工白细胞分类，特别是低白细胞数，且操作人员需要良好的培训，此类仪器也不能提供新的分类参数。
      总之，随着计算机智能化发展，细胞影像数字化是传统细胞形态学分析的革命。但是，不能提供白细胞分类的新概念和新参数。
2. 免疫表型法
      许多方法可用于免疫表型白细胞分类（immunophenotypic leukocyte differential，ILD），如经典血液分析仪法和流式细胞仪法。但是，目前形态学白细胞分类（morphologic leukocyte differentiation，MLD）仍是白细胞分类的参考方法，大多数ILD血液分析仪采用此参考方法进行评估。
      （1）血液分析仪法：Abbott的Cell-Dyn 4000是首先在经典血液分析仪上采用三色流式细胞术进行白细胞分类计数。Sapphire的自动平台也采用同样的原理，多参数分析三色结果，采用3种荧光染料（如绿色异硫氰酸荧光素（FITC）、橘黄色藻红蛋白（PE）、红色藻红蛋白+青蓝5（Cy5））与各种单克隆抗体结合使用。缺点是参数标准化不足、软件专用于ILD。
      （2）流式细胞仪法：目前，免疫表型法白细胞分类仅是一个概念问题。与血液分析仪法原理类似，流式细胞仪首先采用激光照射液流中的细胞，得到细胞大小（前向散射光，FSC）和颗粒（侧向散射光，SSC）信息，可初步将白细胞亚群分为粒细胞、单核细胞和小细胞团（较粒细胞小，可能是淋巴细胞和原始细胞）。
      随后，采用最广泛的免疫表型参数CD45进行染色，形成CD45和SSC图形，其中，粒细胞为高SSC、中CD45，单核细胞为中SSC、高CD45，淋巴细胞为低SSC、高CD45，原红细胞为低SSC、低CD45，幼稚细胞为低SSC、中CD45。通过万能4组合（CD11b/CD14/CD16/CD45）也可定义成熟粒细胞（CD11b+/CD16+）和成熟单核细胞（CD11b+/CD14+）阳性群体。
      对于SSC/CD45散点图来说，在流式细胞仪上应用最广的设门软件是颜色设门（gate-coloring），此参考图形（reference map）可作为任何比例细胞的背景设门（back-gating）方法。最经典应用是法国GTLLF（Groupe de Travail sur les Leucemies et Lymphomas Francophone）工作组对正常骨髓细胞成熟过程的描述。该工作组推荐12种免疫表型组合（见附表）以鉴别正常骨髓细胞，通常采用3种单抗+CD45抗体的组合方式，以万能4色组合鉴别正常骨髓中各类成熟细胞系。其中，第1组能鉴别3系大多数成熟细胞；第2组能提供粒细胞成熟路径，主要为幼稚细胞表达CD34+，过度期表达CD117，成熟期表达CD11b，多为中性分叶核粒细胞；第3组能鉴别原红细胞（CD36和CD71）和成熟单核细胞（CD11c和CD36）；第4组能提供幼稚粒细胞（CD34+）至成熟单核细胞（高CD45、CD33+/CD13+）成熟路径，粒细胞成熟路径由CD34+多能干细胞到CD33+/CD13-、CD33-/CD13+至CD33-/CD13-中性分叶核粒细胞；第5组为单核细胞成熟路径和成熟CD38+/DR-细胞，以及成熟淋巴细胞和CD34+/CD38-、CD34-/CD38+造血细胞，并逐步表达CD45的过程；第6组为成熟B淋巴细胞，表达CD19；第7组为大多数幼稚阶段全能细胞和早期分化髓细胞；第8组为成熟淋巴细胞和分化的NK细胞；第9组为成熟B淋巴细胞（CD10和CD24）、成熟粒细胞（表达CD10和CD24，不表达CD64）和单核细胞（CD64+）；第10组为伴CD7的分化T细胞；第11和12组为成熟淋巴细胞亚群的终末阶段。

      上述适用于正常骨髓细胞的免疫表型分析，有助于了解造血过程中细胞成熟的顺序。而外周血细胞分类的免疫表型分析方法更复杂，不仅需要针对正常个体，而且还需要检出病理情况。
      近10年来，新的血液分析仪更是具备了检测和计数异常细胞的能力，如有核红细胞和幼稚粒细胞。血小板计数已有基于免疫学的分析方法，如Abbott的免疫法血小板计数。总之，基于免疫学的多参数流式细胞术血液分析仪将是白细胞计数和分类的最佳标准，不仅是能够分析更多数量的细胞（>104)，而且能用于血液病的诊断和随访，如最小残留病的检测。免疫表型分类方法最有可能替代传统的光学法，不仅是因为更精确的对异常白细胞亚群的计数和定义，而且很容易用粒子悬液（bead suspensions）对仪器进行校准，如FlowCheck。
三、参考方法
      参考方法主要用于确认自动化血液分析系统的准确性。目前，常采用与常规手工操作类似的方法，但对低值细胞的计数精度不佳。尚在建立和完善的参考方法是采用特定单抗标记特定细胞（包括幼稚细胞）的流式细胞术法，目前，该法已能用于原始细胞、异形淋巴细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和有核红细胞检测。
1.显微镜法
      白细胞分类概念源自显微镜下细胞的形态学检查，似乎其本质就是形态学参考方法。历史上，1977年美国病理学会（CAP）召开会议，讨论如何评价自动白细胞分类仪的结果，1984年国际血液学标准委员会（ICSH）推荐了1981年美国临床实验室标准委员会（NCCLS）起草的白细胞计数参考方法（H20-P），1992年批准文件为H20-A ， 2007年临床实验室和标准委员会（CLSI）修订文件为H20-A2。建立了参考方法后，新的白细胞分类仪在美国食品药品监督管理局（FDA）的管理要求从2001年开始由Ⅲ类降为Ⅱ类，仅需厂商提交510（K）文件，这是1998年国际实验血液学会（ISLH）工作组努力的结果。目前，ISLH工作组和CLSI合作，正在建立扩展白细胞分类计数的新参考方法，以检测和报告有核红细胞、异形淋巴细胞、原始细胞和幼稚粒细胞。
      如前所述，白细胞分类建立参考方法为了提高结果精密度和复现性，通常是对同一份标本制作至少2张血涂片并进行染色，由2位检验人员在显微镜下分别计数200个白细胞，要求首先在低倍镜下（×10）观察整张血涂片，获得其质量的第一印象，寻找红细胞分布均匀的区域，在油镜下（×100）观察细胞的具体结构，此时应注意白细胞数量多少的估计、异常细胞的发现、血小板相对数量多少的估计，以及异常血小板的发现。血涂片检查应避免3类误差，包括涂片分布误差和分类计数区域误差、白细胞计数统计误差和观察者误差。虽然，目前认为白细胞分类显微镜参考方法是最准确方法，但是，耗时且需要有经验操作人员，不适合日常工作。
2.免疫法
      在血液学领域中，新白细胞分类参考方法将不再考虑基于形态学的分类，如前所述的形态学分类的局限性，ICSH新执行委员会正考虑建立白细胞分类的免疫学新参考方法。推荐的参考方法应具有直接检测和计数细胞的能力，要求在总有核细胞少（5个细胞/μl）、细胞频率低（>0.1%）的情况下，检测结果的变异系数应<5%，特别是中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，同样，也能用于幼稚髓细胞、原始细胞、有核红细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和NK细胞的检测。
      2007年，此研究方向取得了一定的进展，Beckman Coulter公司称之为Hematoflow的仪器问世。该仪器是采用单管/5色/6种抗体方案，即CD36/CD2/CRTH2/CD19/CD16/CD45组合，能鉴别外周血12种细胞的亚群。其中，经典的CD45/SSC用于定位白细胞群体，并通过背景设门和颜色核查来确定各亚群的位置。CD36用于鉴别单核细胞和幼稚红细胞。CD2+/高CD45+细胞代表T淋巴细胞和NK细胞，CRTH2+/中CD45/低SSC代表嗜碱性粒细胞。CD2和CD16更精确的识别细胞毒NK细胞。CD19表示幼稚和成熟B细胞，用CD45表达来鉴别。部分高SSC细胞CD16+代表幼稚中性粒细胞、嗜酸性粒细胞（均阴性），成熟中性粒细胞（CD16+）。嗜酸性粒细胞进一步鉴别标志是CRTH2表达。在外周血中，中CD45/低SSC群体可能是原始细胞，进一步精确的判断需其他组合。仪器的专用软件能快速和精确的对外周血细胞进行分类，定位常见细胞亚群。虽然，正常标本借助形态学即能判别，无需应用此方案，但是，此方案与传统形态学相比具有更全面和优越的特点，能计数和分类血细胞的亚群。同样，此组合也能用于髓细胞白血病中异常原始髓细胞的分类，如毛细胞淋巴瘤患者的CD19会表达增加、近期感染者的幼稚粒细胞数量会增加等。
      同样的单抗组合和基于阴性设门的专门软件，还能进一步提高正常和异常标本的鉴别能力。其分离细胞亚群的设门策略为：
      1）B淋巴细胞用CD19/SSC散点图识别；
      2）白细胞表达CD45，以排除非白细胞；
      3）幼稚中性粒细胞表达CD16和CD45；
      4）共同表达CD36、CD2+/CRTH2代表为单核细胞；
      5）和6）CD16表达/SSC散点图用于鉴别幼稚粒细胞和嗜酸性粒细胞，高SSC和CD16表达为NK细胞；
      7）其余T细胞用CD45/SSC散点图左侧区域识别；
      8）和9）剔除嗜碱性粒细胞和清空设门后，所显示的细胞为原始T淋巴细胞和原始髓细胞，按此策略，其他细胞亚群经软件处理后在不同步骤中均能得出。必须强调的是，此方案最大优点是采用复杂的软件设门，比使用更多颜色荧光和单抗更为重要。
      最近，也有提出采用5色/7种单抗，包括用DRAQ5作为有核细胞设门，CD36/CD203/CD138/CD45/CD16/CD56组合。能够识别11种细胞亚群，包括幼红细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、幼稚粒细胞、原始细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、NK细胞、浆细胞和血小板，此方案主要用于异常白细胞的分类。其他有用的组合包括，单管免疫表型用于淋巴增殖性疾病、骨髓发育异常、骨髓瘤或髓细胞增生性疾病的鉴别诊断。
      总之，从形态学出发，仪器能提供快速的、明确的、病理状态答案，如白血病细胞大量增生、细胞数量明显减少。而免疫方法作为新生事物，是一种新的白细胞分类法，必将对疾病的诊断、预后、随访提供更多帮助。目前免疫法仍有争议，是使用通用管对白细胞进行分类，还是使用特定管对特定疾病提供附加信息。但是，很少有人怀疑，随着血液分析仪的进步，仪器将提供更精确的报警，而ILD虽是一种比较昂贵的方法，但良好的设门策略，自动报警解决将是白细胞分类的未来。
                                                                                                   摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第二期
                                                                                                                           编辑：范伟伟

medrt

大哥谢了

meddev

想看看 啊    想学学啊