厌氧菌微量生化板的研制

姑姑机

摘　要：利用预成酶的原理，研制厌氧菌微量生化鉴定板，用国际标准菌株检测其符合率达95.9%，重复率达96.33%。用已知引进参考菌株检测，其符合率达94.84%，重复率达94.33%，而对临床分离的革兰阴性细菌的符合率达81%，对临床分离的革兰阳性细菌符合率达90%，此法效果与国外API-20A产品效果类似，但此法具有快速，操作简便，重复性好等优点，值得在广大临床检测中推广和普及。 　　关键词：厌氧菌　微量生化板　快速诊断
　　早在70年代，我们就采用微量技术对微生物生化性状进行检测，以鉴定微生物的种属。从简易装置开发原理来说，它大致包括两大类产品，一类属于微量接种生长繁殖，再与培养基底物产生反应而用于微生物的生化性状的鉴定，这类装置与传统的微管法类似，如API微量系统，它就是利用微型杯的塑料板，干燥底物，使用时往杯中滴入菌悬液，经过培养一段时间后，再观察其培养基中指示剂改变情况。API系统根据对不同类细菌鉴定的需要又分成4大类，如AIP-20A系统用于鉴定厌氧菌，API-20C用于鉴定酵母菌，此套系统对厌氧菌鉴定的符合率为(80～90)%。另一大类快速生化检测装置是利用预成酶的原理，根据酶与底物的专一性反应，不需依赖细菌生长，而能快速鉴定厌氧菌的生化性状，如国内熊德鑫教授的微量生化板法。我们依据微量生化板法原理加以改良，开发出“厌氧菌微量生化板”用于部分菌种鉴定，结果报告如下：
　　1　材料与方法
　　1.1　根据资料［3］　配制简易生化鉴定20A厌氧菌生化板若干。
　　1.2　指示剂的配置　溴麝香草酚蓝-甲基红指示剂，又简称为BTB-MR液，甲基红溶液：称取甲基红20g，缓冲液加入0.02mol/L，NaOH约30ml，不研磨直至甲基红完全溶解，加蒸馏水至100ml，储存于棕色瓶中放冰箱保存。0.4%溴麝香草芬蓝溶液，称取TBT0.4g，缓冲液加入0.02mol/L naOH约(30～35)ml，研磨直至完全溶解，加蒸馏水至100ml，储存于棕色瓶中放冰箱保存。临用时将上述两种试剂分别用蒸馏水稀释5倍后1∶1混合即可使用。
　　1.3　操作
　　1.3.1　被检菌液的制备　从厌氧培养48h培养物用无菌棉签洗至无菌试管中，测定菌液OD值为4.0～8.0(相当于15亿/ml～30亿/ml)。
　　1.3.2　加入菌液　现将制备菌液置振荡器上振荡(10～20)sec，使其混均后再用灭菌巴氏管将菌液加入微量反应板小孔中，将反应板置湿溶器盒内35℃普通培养箱(4～6)h后观察结果。
　　1.3.3　每次试验都设阴性和阳性对照　阴性对照用PBS液加入，内含指示剂为浅绿色；阳性对照：吲哚试验，具核梭杆菌具核亚种ATCC25586，七叶水解，脆弱类杆 菌ATCC25285，硝酸盐还原：痤疮丙酸杆菌(本室分离株)；触酶试验：使用脆弱类杆菌ATCC25285；尿素酶：使用本室分离的类杆菌。
　　1.4　结果判定
　　1.4.1　糖发酵试验　每个试验孔加入BTB-MR液一滴，砖红色为强阳性(++)，黄色为(+)，绿色为阴性(-)。
　　1.4.2　吲哚试验　加Kovacs试剂1滴，出现粉红色为阳性，无颜色为阴性。
　　1.4.3　硝酸盐还原试验　先加入A试剂(0.5%α-奈胺后加入B试剂(0.8%磺胺酸)各一滴，出现红色为阳性(+)，无颜色为阴性。
　　1.4.4　七叶苷水解　黑色为阳性(+)，无色为阴性(-)。
　　1.4.5　尿素酶　粉红色为阳性(+)，橙黄色为阴性(-)。
　　1.4.6　触酶产生　在甘露醇中滴入10%H2O2，产生气泡者为阳性，不产生气泡为阴性。
　　2　结　果
　　2.2　用国际标准菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化板鉴定结果比较列于表1中。

表1　国际标准菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化板鉴定结果比较

[table=98%][tr][td]菌种名称[/td][td]菌号[/td][td]来源[/td][td]实验次数[/td][td]方法[/td][td]符合率%[/td][td]重复率%[/td][/tr][tr][td]脆弱类杆菌[/td][td]ATCC25285[/td][td]美国[/td][td]4[/td][td]API-21A[/td][td]91.12[/td][td]92.4[/td][/tr][tr][td]　[/td][td]　[/td][td]　[/td][td]　[/td][td]　　Md[/td][td]96.14[/td][td]98.1[/td][/tr][tr][td]小韦荣球菌脆[/td][td]ATCC25285[/td][td]美国