再谈精液检测急待解决的问题

财小弟

作者：中日友好医院  曹兴午教授
        已就中国中医药研究促进会与中日友好医院共同举办《2014年生殖医学论坛》会上，三甲医院一位资深学者的发言，导出了心声与困惑及临床医生对实验诊断学的批评与要求进行介绍，并概括提出建立独立建立精液病理学实验室方式、内容、职责和生物学特征进行介绍，现就一线临床医生提出WHO第五版“尤其13亿人口的大国，在WHO的规范中，缺乏国人精液参数的正常参考值范围，实在令人汗颜，而我们又不能不执行”；“ WHO的标准也在变：使得本来就不确定的标准更更加不确定，尤其是正常精子为4%”的问题进行探讨。
        一、对标准不确定性的分析与认识
        首先参考值标准不确定的变化，正说明对不育症认识的不清楚，对睾丸生殖功能障碍认识的不完善，对检测手段的不成熟，才有更大的探索与研究的空间，给我们思考、判断，这是一种常态现象。变化是正常，不变化时是处于变化过程中。动态观察、思考取舍、避免依从，注意个体差异，对疾病的认识，永远都是在不断探索的过程中，科学研究没有终点。缺乏13亿人口资料确实是最大的遗憾。
        二、男性不育症的分类
        1、国外诊断分类：国外7057例男性不育患者病因统计中，男科不育症特发性精液异常(OAT综合征) 或不明原因为 75.1％(国内引文最多 ) ，为此，国外有2/3的不育症患者病因根本不清，这是国外男科界对不育症认识和研究现状，必然带来不确定性。从而确定了男科界对不育症的诊疗思路与导向。请注意WHO第四版《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》，第五版《人类精液检查与处理实验室手册》，从其修改的含义目的是“处理”而不是为“检验”之用，笔者认为第五版是倾向于或为了辅助生殖技术应用而制定的，所以把健康精子参考值设定在4%。而我们医院实验室的精液检查，是评价不育症患者精液的质量，为临床医生提供诊疗参考，而不是为了进行辅助生殖选取优良精子，如果推行4%，如果在辅助生殖的生殖中心采用该标准，是合情合理。为此笔者认为，根据目的选择采用参考值是比较合适。为此，为了临床诊断治疗采用四版；为了辅助生殖采用五版为宜。
        三、我国不育症精液病理分类
        而我们国内已经有先驱者进行了大量、认真、10年累计性的研究，符合国内以精子为指标，以精液病理学为基础的分类方法列表1。  

       

        多数病理指征阳性，取最严重2项。

        该分类为精液病理的综合性指标[9]：睾丸前、睾丸和睾丸后不同环节均可在精液病理反映，常常呈现特征性变化，以此基础再配合其他必要检查，一般可以落实到睾丸前、睾丸和睾丸后的病因。以无精子的患者确定后，进一步检测生殖激素FSH、LH、T、E2，以及果糖、肉毒碱及α-糖苷酶检查确诊。生殖激素可出现情况：
        1.如果出现FHS、LH和T均低，则主要是睾丸前环节的低促性腺激素性性腺发育不良所致。
        2.如果FSH异常增高则问题在睾丸，为睾丸生精功能衰竭的表现，可能是由于睾丸支持细胞的功能损伤，导致抑制素分泌降低，调控FSH的功能失衡，造成睾丸生精功能衰竭，出现的无精子。
        3.如T/LH比值降低，则是睾丸基膜损伤和增厚，导致睾丸内环境改变，反应了睾丸损伤的严重程度和治疗效果的可能性，再结合临床体检可见睾丸缩小甚至显著缩小，两者是正相关的。
        4.如果生殖激素正常果糖低或阴性，精液量在0.5ml左右，pH值为6.4左右，可基本确定是阻塞性，阻塞部位在精囊腺射精管。
        5.如果生殖激素正常，主要是肉毒碱，α-糖苷酶明显降低，则主要阻塞在输精管或附睾。
        四、精子形态学选用染色方法与标准问题
        1.历史的回顾：25年前笔者进行精子形态与生殖细胞研究时，首先考虑的选用的染色方法，为此，实验了瑞氏染色、姬氏染色、瑞-姬染色、美篮染色、巴氏染色、H-E染色、铁明矾-苏木素染色、荧光染色等多种方法。普通显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜（透射、扫描）观察。最后选的瑞-姬染色方法，进行一系列几十年研究观察，并与临床密切合作，实现了实验室与临床密切结合之路，至今耄耋之年，仍然不离不弃、魂牵梦绕。
        2.我考虑的选用原则是：①能够达到观察的形态标准要求，如对细胞形态特征、细微结构、分辨清晰；②符合国情，不仅研究可用，基层更可以采用；③简单、易行、普遍，；④容易配制（自己可以研磨配制）；⑤重要是任何医院有化验室时，都具有看血片分类的染色方法，开展非常方便。而采用巴氏染色需要固定、染色、脱水、封片等十几道工序，不适宜在临床实验室使用。现在回顾仍然感是不虚的尝试。
        3. 观察结果：经过7年团队共同努力（天津医学院检验系学生辛 旸、胡进坊、程 岗和同事王兰英、苏孟荣等）观察、测量、计算、绘图，于1992年《107例生育组与不育症精子形态与生精细胞定性与定量分析》一文发表在中华检验医学杂志上，均为经瑞-姬染色，油镜观察结果。精子形态学分类和生精细胞的检出：生育组正常精子为92.6%，畸形精子为7.4%；不育组为86.7%，畸形精子为13.3%，正常与异常精子形态进行介绍与描述（手绘图）和分类。对各种生精细胞的形态进行描述并绘图介绍，生精细胞的检出:有3~4种生精细胞在生育组为86%；不育组100%，对两组进行分类，从而取得了生精细胞的检出资料。对生精细胞进行了每毫升的定量计数分析，经t检验，除精原细胞以外，其他生精细胞均有显著差异。为临床观察诊疗提供了实验数据[]。为此，在国内首次系统详细报道，开创了生精细胞学检测的新时代。该论文获得中华医学会北京分会优秀论文奖。
        4.采用该方法对北京地区男性不育症精子畸形率22年连续监测：

       

        笔者矢志不渝的检测生育力状况，在观察方法一致、人员技术水平固定的情况下，20余年不育者精子畸形率显著增加，2012年与1912年比增加3.1倍，与2013年比增加3.78倍。
        5.当前精液质量的现状：
        精子畸形率高，活动力差、精子数量少，精液质量下降是表现。说明睾丸损伤导致生精障碍日趋严重，大约有150种有害因素造成睾丸病理学损伤，必然造成生精细胞凋亡、胀亡和坏死，引起生育力降低，威胁人类生殖健康，更严重人口资源的大问题。
        6.形态学检测不能忽视：
        精液检测一直是检验科的弱项，即使是在三甲医院也是如此，形态学更是逐渐淡化的检验内容，笔者不否认仪器、大数据、大检验科是当今发展的趋势，高精尖是必要，但传统的优良的、行之有效、几代人传承而无法取代的形态学，不能从我们手中丢失，到那时历史会做出公正的评审。
        （1）瑞-姬染色法：精子形态

       

        （2）原位缺口末端标记（TUNEL）法：精子凋亡形态

       

        （3）扫描电子显微镜下精子

       

        （4）相差显微镜下支原体感染精子

       

        新鲜精液中，相差显微镜观察支原体感染精子，体表附着的支原体群，导致精子为弱精子，或是死生精子，进一步可以在前列腺小体和生精细胞中检测到支原体。
        五、呼吁与期待
        男科学发展迅速，男性不育症患者众多，但我们缺乏规范化、可行性诊疗指南，缺乏大规模、大手笔的系统性研究。谁来管？谁组织？是检验医学会？是男科学会？迫在眉睫。
        1.希望中华医学会中华检验医学会、中华男科学会，重视男科学实验诊断的应用与发展，切实关怀精液病理学的检测与临床应用，认真体贴临床医师的苦衷与困难（不仅要超负荷看病人，还必须面对病人的诸多质疑）。诸多问题，客观存在，不能回避，积极面对，实为上策。
        2.建立统一的男性实验诊断规范化管理机构，统一管理不育症的检测与质量控制管理。
        3.开展规范化、统一的资料库，建立我国男科学诊断与治疗标准（手册）。
        4.培养男科实验室人才，学科要发展，人才是关键。
        结语：随着科学仪器的发展，流式细胞仪、核磁共振、透射电镜、免疫电镜、激光共聚焦显微镜等仪器出现，睾丸细胞生物学领域的研究大有可为，如分子生物学、精子功能、间质细胞的分泌与机体的平衡、失衡与调节，支持细胞骨架，支持细胞与生殖细胞的调节与精子的生成与成熟等等。总之，不育症的诊断与诊疗的落脚点与着眼点应该是睾丸的生殖生理功能变化。但不是一蹴而就的，任重道远，共同努力，千里之行始于足下。
        参考文献略