脑脊液常规检查的标准化操作

孔雀明王

脑脊液常规检查的标准化操作，适用于脑脊液的常规检查(物理检查、蛋白定性、细胞检查)；
        一、脑脊液标本的采集：
        1.标本种类：脑脊液，由临床医师进行腰椎穿刺采集，必要时可从小脑延脑池或侧脑室穿刺获得。
        2.标本要求：将脑脊液分别收集于3个无菌试管中，第一管作细菌培养，第二管作化学分析和免疫学检查，第三管作一般性状及显微镜检查。每管收集1-2毫升。
        3.遇高蛋白标本时可采用EDTA K2抗凝。
        4.标本储存：立即送检。
        5.标本运输：室温运输。
        6.标本拒收标准：污染，久置标本。
        7.器材试剂：5%苯酚溶液：取纯苯酚25ml,加蒸馏水至500ml，用力振摇，置37℃温箱内1-2天，待完全溶解后，置棕色瓶内保存。细胞计数板；显微镜。
        二、脑脊液的常规检查：
        1.物理检查：
       

       

•                  目测脑脊液颜色与透明度:
  

       

        (1)观察颜色。        
        (2)观察透明度。
        (3)观察凝块或薄膜：收集脑脊液于试管内，静置12-24小时，正常脑脊液不形成薄膜、凝块和沉淀物。
       

       

•                  结果判断与分析：
  

       

        颜色：正常脑脊液是无色透明的液体。在病理情况下，脑脊液可呈不同颜色改变:
        (1)红色：常由于各种出血引起。脑脊液中出现多量的红细胞，主要由于穿刺损伤出血、蛛网膜下腔或脑室出血引起。前者在留取三管标本时，第一管为血性，以后两管颜色逐渐变淡，红细胞计数结果也依次减少，经离心后上清液呈无色透明。当蛛网膜下腔或脑室出血时，三管呈均匀红色，离心后上清液显淡红色或黄色。红细胞在某些脑脊液中5分钟后，即可出现皱缩现象，因此红细胞皱缩现象不能用以鉴别陈旧性或新鲜出血。
        (2)黄色：可因出血、梗阻、郁滞、黄疸等引起。陈旧性蛛网膜下腔或脑室出血，由于红细胞缺乏蛋白质和脂类对膜稳定性的保护，很易破坏、溶解，出血4-8小时即可出现黄色。停止出血后，这种黄色仍可持续3周左右。椎管梗阻如髓外肿瘤，格林-巴利综合征，当脑脊液蛋白质量超过1.5g/L时，颜色变黄，其黄色程度与蛋白质含量呈正比。化脓性脑膜炎、重症结核性脑膜炎时，因脑脊液蛋白质含量明显增加而呈淡黄色或黄色。重症如核黄疸、新生儿溶血病时脑脊液也呈黄染。
        (3)白色或灰白色：多因白细胞增加所致常见于化脓性脑膜炎。
        (4)褐色或黑色：常见于脑膜黑色素瘤。
       

       

•                 透明度：正常脑脊液应清晰透明。病毒性脑炎、神经梅毒等疾病的脑脊液也可呈透明外观。脑脊液中白细胞如超过300×106/L时可变为混浊；蛋白质含量增加或含有大量细菌、真菌等也可使其混浊；结核性脑膜炎常呈毛玻璃样微混；而化脓性脑膜炎常呈明显混浊。
  

       

        填写报告时用“清晰透明”、“微浑”、“浑浊”等描述。
       

       

•                 凝块或薄膜：正常脑脊液不形成薄膜、凝块和沉淀物。若脑脊液内蛋白质包括纤维蛋白质多于10g/L即可出现凝块或沉淀物，结核性脑膜炎的脑脊液静置12-24小时后，可见表面有纤维的网膜形成，取此膜涂片检查结核杆菌，阳性率较高。蛛网膜下隙梗阻时，由于阻塞，远端的脑脊液蛋白质含量常高达15g/L，此时脑脊液呈黄色胶冻状。
  

       

        填写报告百可用“无凝块”、“有凝块”、“有薄膜”、“胶冻状”等描述。
        2、蛋白定性试验(潘氏法)：
       

       

•                 实验原理：脑脊液中球蛋白与苯酚结合，可形成不溶性蛋白盐而下沉，产生白色浑浊或沉淀。        
  
•                 试验方法：取潘氏试剂2-3ml于小试管内，用毛细滴管滴入脑脊液1-2滴，衬以黑背景，立即观察结果。        
  
•                  结果判断：
  

       

        阴性：清晰透明，不显雾状；
        极弱阳性（±）：微呈白雾状，在黑色背景下才能看到； 弱阳性（+）：灰白色云雾状； 阳性（+）：白色浑浊；
        强阳性（3+）：白色浓絮状沉淀； 最强阳性（4+）：白色凝块；
        3、细胞检查：
        在显微镜下对脑脊液有形成分进行计数和分类检查。
       

       

•                 细胞总数：
  

       

        （1） 对澄清的脑脊液可混匀后用滴管直接滴入计数池，计数10个大方格内红、白细胞数，其总和即为每µl的细胞数。再换算成每升脑脊液中的细胞数。如细胞较多，可计数一大格内的细胞×10，即得每µl脑脊液中细胞总数。如用升表示，则再乘以106。也可用生理盐水或红细胞稀释液稀释后再用人工计数，或直接用血细胞分析仪进行计数；
        （2）浑浊或带血的脑脊液可用血红蛋白吸管吸取混匀的脑脊液20µl，加入含红细胞稀释液0.38ml的小试管内，混匀后滴入计数池内，用低倍镜计数4个大方格中的细胞总数，乘以50，即为每µl脑脊液的细胞总数。
       

       

•                 白细胞数：
  

       

        （1）非血性标本：小试管内放入冰乙酸1-2滴，转动试管，使内壁沾有冰乙酸后倾去之，然后滴加混匀的脑脊液3-4滴，数分钟后，混匀充入计数池，按细胞总数操作中的红、白细胞计数法计数。
        （2）血性标本：将混匀的脑脊液用1%冰乙酸溶液稀释后进行计数。为剔除因出血而来的白细胞数，用下式进行校正。
        每µl脑脊液内白细胞校正数：
                                                        每µl脑脊液内红细胞数×每µl脑脊液内白细胞数
        =每µl脑脊液内白细胞未校正数－                                               
                                                            每µl血液内红细胞数
         
        例示：血液内红细胞4 000 000/µl；  脑脊液内红细胞20 000/µl；
        血液内白细胞10 000/µl；      脑脊液内白细胞60/µl
         
           则：60－ 20 000×10 000 =60-50=10； 即该患者脑脊液内白细胞之校正数为10。                  
        4 000 000
        （3）成人脑脊液内无红细胞，白细胞极少，其参考范围：
        腰池中为（0-10）×106/L；
        脑室内为（0-5）×106/L；
        儿童为（0-15）×106/L，
        新生儿为（0-30）×106/L。
        如白细胞达（10-50）×106/L为轻度增加，（50-100）×106/L为中度增加，200×106/L以上显著增加。
       

       

•                 细胞分类：
  

       

        （1）直接分类法：白细胞计数后，将低倍镜换为高倍镜，直接在高倍镜下根据细胞核的形态分别计数单个核细胞（包括淋巴细胞及单核细胞）和多核细胞，应数100个白细胞，并以百分率表示。若白细胞少于100个，应直接写出单核、多核细胞的具体数字。
        （2）染色分类法：如直接分类不易区分细胞时，可将脑脊液离心沉淀，取沉淀物2滴，加正常血清1滴，推片制成均匀薄膜，置室温或37℃温箱内待干，进行瑞氏染色后用油镜分类。
        如见有不能分类的细胞，应另行描述报告，如脑膜白血病或肿瘤时。
        （3）正常脑脊液中白细胞主要为单个核细胞，多为淋巴细胞及大单核细胞，两者之比约为7：3，偶见内皮细胞：软脑膜和蛛网膜细胞、室管膜细胞、脉络膜细胞等。
       

       

•                  寄生虫学检查：经沉淀涂片认真寻找虫卵、幼虫等。
  

       

        三、质量控制：进行室内工作人员比对分析，要求差异在10％以内。
        四、临床意义：
       

       

•                  脑脊液蛋白质含量增加，提示患者血脑屏障受破坏，常见于脑、脊髓及脑膜的炎症、肿瘤、出血等以及脑软化、脑退化性疾病、神经根病变和引起脑脊液循环梗阻的疾病等，当脑脊液中蛋白质在10g/L以上时，流出后呈黄色胶冻状凝固，而且还有蛋白-细胞分离现象，临床上称为Froin综合征，是蛛网膜下腔梗阻性脑脊液的特征。        常见中枢神经系统疾病的脑脊液检查特点
  

       

•                 中枢神经系统感染性疾病时脑脊液根据细胞病理学变化分三个不同时期：
  

       

        ①     急性炎性渗出期，呈粒细胞反应；
        ②     亚急性增殖期，呈激活淋巴细胞或单核-巨噬细胞反应；
        ③     修复期呈淋巴细胞反应。化脓性脑膜炎的急性期变化最突出，持续时间最长；此期脑脊液细胞数每微升可高达数千，以中性粒细胞为主，当用抗生素治疗后，脑脊液细胞数迅速下降。梅毒性脑炎亚急性期出现较早，持续时间较长，脑脊液中细胞数轻度增加，以淋巴细胞为主，在单纯疱疹病毒性脑炎的脑脊液淋巴样细胞中可发现胞质内包涵体，结核性脑膜炎时其脑脊液细胞数可增加，但超过500×106/L者较为罕见，在发病初期以中性粒细胞为主，但很快下降，由于患者多在发病数天后才来诊治，因此首次腰穿时，脑脊液中中性粒细胞已趋下降而淋巴细胞为多。粒细胞、淋巴及浆细胞同时存在是结核性脑膜炎的特点。新型隐球菌性脑膜炎可在脑脊液中直接发现隐球菌，必要时用印度墨汁染色予以确诊。
       

       

•                       中枢神经系统肿瘤脑脊液细胞总数可正常或稍高，以淋巴细胞为主。脑脊液中能否找到肿瘤细胞取决于肿瘤位置及恶性程度、穿刺部位和采集标本的多少。同时也与检查者技术水平有关，采用细胞正玻片离心沉淀仪可提高检出率。脑脊液找到白血病细胞是白血病脑膜转移的证据。        
  
•                       脑血管病脑脊液细胞学检查有助于鉴别脑出血或腰穿损伤性出血。前者在早期病后数小时可见大量红细胞和明显中性粒细胞增多，2-3天内达高峰，在脑脊液中可发现吞噬细胞，出血后数小时至第3天可出现含有红细胞的吞噬细胞，5天后可见含铁血黄素吞噬细胞。如为穿刺损伤性出血则不会有上述反应。        
  
•                       脑寄生虫病不仅脑脊液细胞数升高，并可见嗜酸性粒细胞增多，约占白细胞的60%或更高。浆细胞增多为另一特点。如将脑脊液离心沉淀物全倾倒在玻片上，在显微镜下检查可发现血吸虫卵、阿米巴原虫、弓形体、旋毛虫的幼虫等，甚至还可找至细粒棘球绦虫的头节或头钩。        
  
•                       红斑狼疮有时可在脑脊液中找到红斑狼疮细胞。
  

       

        五、方法学评价：
        潘氏试验所需标本量少，灵敏度高，试剂易得，操作简便，结果易于观察，其沉淀多少与蛋白质含量成正经比，部分正常脑脊液亦可出现极弱阳性结果。Ross Jine试验主要沉淀的是球蛋白，但敏感性较弱，NoneApett试验可分别检测球蛋白和白蛋白，但操作较繁，极少选用。细胞计数为手工法，存在人为误差。细胞较少时应增加计数池计数面积。当穿刺损伤血管导致血性脑脊液或出血性脑血管病时，计数细胞总数已无意义，白细胞数亦须经校正。
        六、操作注意事项：
        1.脑脊液标本必须立即送验及时检查，放置过久将影响检验结果，使细胞破坏、 变性、或细胞包裹于纤维蛋白凝块中，导致细胞数降低、分类不准确等。存放中的脑脊液葡萄糖会分解，使之含量降低；细菌自溶或破坏可影响细菌检出率等。
        2. 取材后，必须立即涂片。
        3.推好的血膜片应在空气中摇动，使其尽快干燥，以免细胞变形。天气寒冷或潮湿时，应于37℃温箱中保温促干，以免细胞变形缩小。
        4.根据血膜厚薄，细胞量多少及室内温度等把握好染色时间，使染色效果满意。
        5.镜检时循序检查，必要时用油镜确认；并注意整体情况。
        6.细胞计数时，应注意新型隐球菌与白细胞的区别。前者不溶于乙酸，加优质墨汁后可见不着色的夹膜。
        7.计数池用后，应用75%乙醇消毒60min。忌用苯酚消毒，因有损计数池的刻度。
        注：参考文献：中华人民共和国卫生部医政司编。全国临床检验操作规程（第二版）17-18页，145-147页。