尿液蛋白质电泳分析的应用和进展

银狐

                                                                       中南大学湘雅二医院肾病实验室     李江综述 夏运成审校
       【摘要】尿蛋白电泳技术通过分析尿蛋白组成成分，可帮助明确其来源及含量，从而有助于疾病的诊断和预后的判断。近年来，尿蛋白电泳技术在多方面取得了较大的突破和发展，使检测更加快速、操作更加方便、灵敏度更高，现就这方面的进展作一简要综述。
       【关键词】电泳；尿分析；蛋白质类；肾疾病/诊断

       尿液蛋白质电泳技术以其全面、快速、简便、无损伤等特点，逐渐发展成为一种检测尿蛋白的重要手段。自1960年Blainly首先提出尿蛋白选择性的概念作为判断。肾小球损伤严重性的指标后，尿液蛋白质电泳技术的重要性逐渐被认识，该技术对于出现蛋白尿的患者初诊时可辅助判断疾病产生部位；对于肾脏及肾脏外损害的患者可观察治疗过程中疗效；对于肾脏及肾脏外损害的患者定期检测可监测疾病进展。目前，临床建议多种疾病如各种肾脏病、多发性骨髓瘤、心血管疾病、糖尿病、急性白血病、中毒性疾病、溶血性疾病、红斑狼疮以及严重创伤等均应进行尿液蛋白质电泳检查。
尿液蛋白质电泳分析技术在肾脏疾病中的应用价值
       蛋白尿是肾脏疾病最常见的表现和就诊原因，鉴别尿液中蛋白质的性质、来源是诊断和治疗各种肾脏疾病的关键。实验医学中传统应用的各种尿蛋白检测方法具有相当的局限性，难以系统、全面地分析肾损伤的部位和程度 虽然肾活检技术可以用来确定肾脏损伤的部位和程度，并且诊断准确性高，但由于其是创伤性诊断技术，存在很多不足之处，如患者的恐惧、焦虑；可能造成出血、感染等。
       最新的尿液蛋白质电泳技术已经可以使人们将非浓缩尿蛋白成分按分子大小分离出各种蛋白组分，因此可以根据各组分的出现与否判断肾脏损伤的部位和程度，而且能较全面地反映肾脏的整体情况。许多资料结果表明，尿蛋白电泳与肾活检结果相符，并且具有无任何损伤、取材方便、报告快速准确等优点。诸多研究也证明[1-2]，用SDS-PAGE等尿蛋白电泳技术进行蛋白分型出现低分子量蛋白与慢性肾功能衰竭的较高复发率显著相关，也和肾小管萎缩、小管间质损伤和血管内侧增生相关。
尿蛋白电泳技术的发展
       近年来，电泳技术同绕加样、支持介质、缓冲系统、电泳装置、染色及检测等方面不断发展，分辨率有了很大的提高，并且已经完全可以达到按体液中蛋白质分子量的大小进行电泳分析的目的。这些最新技术也同样应用了尿蛋白电泳技术。
       1．电泳支持介质的改进；电泳支持介质的发展是电泳技术各方面发展最为迅速的一面。由流动相改为固相支持物，从纸电泳到薄膜电泳再到凝胶电泳，电泳技术的分辨率越来越高。滤纸因其对蛋白质有吸附作用，且不同蛋白质组分吸附的多少比例不等，使结果不可靠，因而已被临床淘汰。采用醋酸纤维素薄膜或琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，能将血清中的蛋白质分出5～6条区带。采用淀粉胶或聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持介质，由于它们的分子筛效应能将血清蛋白产生25条以上区带。
       醋酸纤维素薄膜：醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯，该物质制成的薄膜被称为醋酸纤维素薄膜。它具有电渗小、分离速度快、分离清晰及操作简便等优点，是我国开展较普遍的一种电泳技术，其原理是根据各种蛋白质等电点的不同，在同一pH值条件下，蛋白质所带电荷量的多少有差别，另外结合不同蛋白质分子的大小、形状差异，在电泳中会产生不同的电泳速度。
       但将醋酸纤维素薄膜作为尿液蛋白质电泳的支持介质，存在诸多不足之处：尿液标本需要预浓缩，而且不能单纯按蛋白质分子量大小进行分离；电泳后须将薄膜染色透明，通过对膜的光密度扫描进行蛋白成分定量；醋酸纤维素薄膜吸水性差，含水量少，电泳时水分容易蒸发，易造成蛋白质变性和破坏膜片；膜片浸泡后很难操作，容易扭曲；此外，染色和脱色条件不易控制。
       凝胶：凝胶作为尿蛋白电泳的支持介质比醋酸纤维素薄膜有更好的分辨率。低浓度的琼脂糖凝胶电泳相当于自由界面电泳，蛋白质在电场中可自由穿透，阻力小，不被凝胶吸附，使蛋白电泳图谱无拖尾现象。分辨清晰，透明度高，能透过200～700nm波长的光线，故电泳结束后无须进行透明，可减少操作步骤及由此引起的实验误差，又因底板无色泽，提高了对着色区带的检测灵敏性。聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，蛋白质可以因分子大小形状不同而得到分离[3-4]。
       2．电泳方法、原理的改进：十二烷基磺酸钠的使用：十二烷基磺酸钠(sodium dodecy sulphate，SDS)是一种阴离子型表面活性剂，当其浓度达到蛋白质浓度的5～10倍时，与还原剂共同作用，能使蛋白质分子内的氢键及二硫键断裂，解离成单独的亚基，亚基与SDS充分结合形成带负电荷的亚基——SDS胶束，所带的电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。流体动力学的研究证明，这种复合物呈椭圆形，短轴约为1．8埃(A)，但长轴的长度与亚基分子量的大小成正比，加之琼脂糖凝胶的分子筛作用，使电泳的迁移率与摩擦系数的反比关系只表现在蛋白质分子大小上，因此尿液蛋白质各组分便可按分子量的大小顺序而排列在凝胶上，经烘干、固定、染色后和标准蛋白分子区带比较，即可判断蛋白质的性质和分子量范围，便于作肾单位损伤病理性分析。
       十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：20世纪60年代Shapiro建立了SDS-PAGE方法，随后Weber、Glossmann和Donglass等对其进行了多次改进，使其逐渐显示出在分离、鉴别、纯化蛋白质等方面的优越性。1972年Peace采用该技术成功地对肾小球性尿蛋白与肾小管性尿蛋白进行了鉴别。此后由于该方法极高的分辨率逐渐被应用于肾脏病的临床实验诊断中。但此法对于微量或少量蛋白尿患者的尿液，需要经过一定时间的浓缩使尿蛋白达到一定的量才能进行电泳测定，致检验时间延长。一次实验常需4～5天才能报告结果，不利于疾病及时诊断，而且浓缩可导致染色背景过深，并有可能伴有低分子量蛋白质的丢失。此外，盘状电泳的结果判断采用肉眼直接观察，影响了结果的可靠性，在我国已逐渐被淘汰。
       为克服以上不足，SDS-PAGE技术不断得到改进，半薄SDS-PAGE垂直平极电泳技术应运而生，其结合高效银染和激光扫描的方法，对于仅有微量蛋白尿的患者，可以直接将未浓缩的尿液进行电泳，并经计算机软件对电泳出现的条带进行定位。从而能简便、准确、及时地判断蛋白尿的不同蛋白类型特征，为进一步区分患者尿蛋白的原因提供了帮助。半薄SD-PAGE垂直平板电泳的仪器设备简单，试剂易于配制，技术操作简单；由于采用厚度为1mm 的普通凝胶板，易于扫描时光线透过。提高了电泳条带的识别分辨能力，所得结果直观，便于分析判断；同时缩短了检测时间，整个检测过程不超过1天半；染色采取银染方法，条带的清晰度优于G-250染色[5-6]。
       十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶电泳(SDS-AGE)：这种方法是在琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE 的基础上改进而发展起来的，其利用琼脂糖凝胶的选择性成分及多孔性，结合SDS的应用，可有效地分离尿液中的不同蛋白质组分，以尿液蛋白质成分中含量最多的白蛋白为界，可将尿蛋白分为低、中、高分子蛋白带。尿蛋白电泳后呈现出中、高分子量蛋白区带，主要反映肾小球病变；呈现低分子量蛋白区带，可见于肾小管病变及溢出性蛋白尿；混合性蛋白尿则可见大、中、小各种分子量区带，提示肾小管及肾小球均受累及。扫描仪可对电泳后尿液中蛋白质谱象进行扫描。求出百分比，以显示肾小球或肾小管损伤程度，其电泳图谱及扫描图像可作为资料记载，利于分析比较[3]。该技术采用高敏感性染色液，尿液不需预浓缩，可直接进行检测，操作简便，结果清晰，仅需3h即可完成检验，还备有完整的定性标准，易于量化，便于分析，对肾脏疾病的诊断、鉴别诊断、指导治疗和判断预后颇有价值[7-8]。
       等电点的应用：等电点(pI)是蛋白质的一个重要性质，测定等电点的方法是在不同pH值条件下测定蛋白质的电泳迁移率，然后用迁移率对pH 值作图，对应于迁移率为零的pH值就是蛋白质的等电点。
       等电聚焦电泳：按照蛋白质等电点不同进行分离的电泳技术称为蛋白质等电聚焦电泳(isoelectric focusing electrophoresis，IEF)。IEF是一项具有很高分辨能力的技术，应用窄pH值范围的两性电解质混合物，可将pI 差值只有0.02pH值单位的大分子物质清晰分开。在一些特殊情况下，也可将pI 差值小到0.001 pH值单位的蛋白分子分开。聚丙烯酰胺凝胶是IEF 选用最广泛的介质，电泳区带规整，很少或可以说没有区带的扩散。琼脂糖凝胶经选择和处理，孔径较大，电内渗消除后也可用于IEF，临床应用可得到高分辨率、高重复性结果。
       双相电泳：双相电泳(two-dimensional electrophoresis，2DE)，顾名思义，这项技术需分两步进行，第一步基于电荷特性(载体两性电解质和pH 梯度)进行IEF电泳，IEF后取出电泳胶与第一步电泳方向呈90°角进行SD-PAGE平板电泳。双相电泳系统于1975年由O’Farrell 提出，由于其极高的分辨率被称为“蛋白炸裂(protein explosion)”，蛋白检测限可达10ug/dl，分离后蛋白质斑点的检测主要用银染的方法，通过自动扫描和计算机控制数据处理装置解决。经过近30年的发展，已经克服了第一相电泳中存在的阴极漂移、pH梯度不稳定、重复性不好等问题。虽然2DE有极高的分辨能力，但是其操作繁琐，尿液需要预浓缩，一般临床实验室难以开展。Harriso 等提出在未来常规工作中可应用2DE的几个方面：(1)a1-抗胰蛋白酶分型；(2)一些寡克隆或多克隆蛋白带图谱用其他技术分辨不清者；(3)载脂蛋白E分型；(4)某些遗传性疾病基因缺失状态或多型血清蛋白的分型[9]。
       与免疫技术的结合：1969年Alper与Johnson在原有几种免疫电泳方法的基础上改进出一种新技术—— 免疫固定电泳(IFE)，该技术包括琼脂糖凝胶蛋白电泳和免疫沉淀两个过程的操作，是免疫沉淀反应的一种混合技术，检测标本包括血清、尿液、脑脊液及其他体液。其最大的优势是敏感性达50～150mg/dl，操作周期短，仅需数小时，分辨率高，结果易于分析[3]。
       毛细管原理的应用：毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)或高效毛细管电泳(high performanee capillary electrophoresis，HPCE)是80年代初在传统电泳基础上继现代高效液相色谱(HPLC)技术之后发展起来的一种新型高效、快速的分离技术。它融合了HPLC 和常规电泳两项技术的优点于一身，具有高分辨率、高选择性、定量准确、所需样本量少等特点。
       典型的样本体积小到毫微升(nl，10-9 升)至微微升(pl，10-12 升)；检测器可采用不同类型。包括吸收光、荧光、电导率、电化学、质谱或放射性同位素检测。CE 分离时间一般不超过10min；电泳载体被移至毛细管中后，克服了传统电泳的热扩散和样本扩散的难题，大大提高了灵敏度。在生物医学领域应用CE 最成功的实例是血清蛋白和血红蛋白多种变异体的分离。同样，尿液和脑脊液样本在没有预浓缩的条件下也成功地进行了多种成分的分析[10]。
       迄今为止，该项技术已广泛应用于有机离子、无机离子、氨基酸、多肽、蛋白质、DNA序列、对应异构体以及临床医药分析，成为目前分析化学中十分活跃的研究领域之一。此外，毛细管电泳可与其他分析技术联用，更增加了毛细管电泳的运用范围，目前被临床实验室所接受的毛细管电泳技术为毛细管区带电泳(CZE)[11]。
       微流控芯片电泳：最近，王惠民等[12]在已有微加工芯片技术的基础上，自行研制了微流控电泳芯片，并用于分离尿蛋白取得了初步成功。微流控芯片电泳与普通区带电泳原理不完全一样。微流控芯片主要以电渗流作为蛋白区带的驱动力。玻璃或石英芯片在中性或碱性pH 下，其表面带负电荷，液流中与其相邻的部分形成沿通道壁的带正电荷的界面，在通道两端施加高电压，带正电荷的电场作用下产生迁移，继而带动通道内界面包裹的液流产生电渗流，使液体向负极移动，在碱性条件下，蛋白质虽带负电荷，因电渗流的力大于电荷作用力，蛋白质分子亦向负极泳动，与普通区带电泳相反，带负电荷越多的蛋白质分子泳动越慢。本方法电泳的分离效果与Helena琼脂糖凝胶电泳相一致，且快速简便，电泳时间仅需2min。整个操作过程在2h内完成，具有良好的重复性，测定费用十分低廉。但该法灵敏度有限，尿液需要预浓缩[12]。
结 语
       随着国际、国内科技发展的日新月异和检验医学发展的突飞猛进，电泳技术也在不断地发展和更新，一些新技术、新原理也不断地应用到电泳技术当中，电泳技术将朝着自动化程度高、检测速度快、检测项目全、灵敏度高的方向发展。在尿液蛋白质电泳方面，微量蛋白、小分子量蛋白电泳技术，定量、半定量检测技术必将成为今后的发展方向。
参考文献
1 戴慧莉，钱家麒，严玉澄．低分子量尿蛋白在原发性肾小球肾炎中的作用．上海第二医科大学学报，2003，23(5)：423-426．
2 Bazzi C，Petrini C．Rizza V。et a1．A modern approach to selectivity of proteinuria and tubulointerstitial damage in nephrotic syn drome．Kidney Int，2000，58(4)： 1732-1741．
3 沈霞．电泳技术的现状和发展．中华检验医学杂志，2001，24(5)：263-265．
4 赵绍林，吴惠毅，杨新玲，等．超薄琼脂糖凝胶的简易制备技术．临床检验杂志，2004，22(4)： 251．
5 沈霞，张敏华，汪萍。等．非浓缩尿蛋白电泳的临床应用．中华检验医学杂志，2001，24(5)： 266-268．
6 俞海瑾，董晓蓓，陈楠．肾小球疾病中尿蛋白电泳测定及其病理相关分析．上海医学，2001，24(2)： 115-117．
7 高原．葛青玮，蒋巍．非浓缩尿琼脂糖蛋白电泳及其l临床应用．上海医学检验杂志，2002，17(3)：160-161．
8 吴惠毅，孙召东，刘安定，等．尿蛋白SDS-琼脂糖凝胶电泳方法建立及临床应用．临床检验杂志，2004，22(5)；341-343．
9 Meier M ，Kaiser T，Herrmann A，et al．Identification of urinary protein pattern in type 1 diabetic adolescents with early diabetic nephropathy by a novel combined proteome analysis．J Diabetes Complications，2005，19(4)： 223-232．
10 Jenkins MA．Quality control and quality assurance aspects of the routine use of capillary electrophoresis for serum and urine proteins in clinical laboratories．Electrophores ．2004．25(10-11)：1555-1560．
11 Wittke S，Fliser D，Haubitz M ．et al． Determination of peptides and proteins in human urine with capillary electrophoresis-mass spectrometry，a suitable tool for the establishment of new diagnostic markers．J Chromatogr A，2003，1013(1-2)：173-181．
12 王惠民，孙承龙，王跃国，等．微流控芯片电泳在快速分离尿蛋白中的临床应用价值．中华检验医学杂志，2004，27(9)：551-554．
                                                                                                                        编辑：范伟伟