尿液有形成分镜检与自动化检测方法学利弊和互补分析

财小弟

                                                                                        解放军总医院临床检验中心     丛玉隆 马骏龙
       【摘要】结合当前国内外尿液分析的发展现状和目前国内常规检验工作忽视尿有形成分检查的错误倾向，笔者参考国家(际)标准、文献及本人的临床实践、科研成果，阐述了尿液有形成分检查的临床价值、标准检验流程，评论了应用各种仪器进行镜检筛选的优点与不足，并对如何加强我国尿液分析的质最管理提出了见解。
       【关键词】尿分析；显微镜检查
一、尿液有形成分检查的操作规范[1-3]
       2002年，卫生部颁布的尿液分析文件中有关有形成分检查的操作规程为：“尿液10 ml，离心5 min，相对离心力(RCF)为400×g，剩余沉淀为0.2 ml，混匀后吸沉淀物约20 ul，滴在玻片上，用18 mm×18 mm盖玻片覆盖后镜检。先用低倍镜(×100)观察全片，再用高倍镜(×400)仔细观察，细胞检查10个高倍视野(HP)，管型检查20个低倍视野(LP)”。报告方式为“个细胞/HP”、“个管型/LP”。美国NCCLS文件(GP-16A)推荐使用一次性尿检测板，并用“个/ul ”报告。4种常见尿沉渣检查法(载玻片不加盖片法、载玻片加盖片法、改良Neubauer盘、Fast-Read-10R标准板法，即一次性尿板法)计数并进行CV 值比较的结果显示，白细胞：15.0%、12.0%、10.2%、9.3%；红细胞：17.0%、15.0%、9.9%、7.0%。目前，我国许多实验室使用一次性尿板法，操作方便、规范、经济、计数精确，收到良好效果。
       20世纪90年代初，自动(半自动)充液(尿)配以标准化计数装置和多媒体显微成像、检验人员可在荧幕前计数、并能清晰观察细胞形态的仪器逐步进入我国市场，例如Diasys尿沉渣检验工作站、CenSide2000尿沉渣检测系统。该类仪器既能使计数标准化，同时又减少了工作强度，对我国“尿沉渣”检查标准化起到了一定的促进作用。但由于其检验标本速度较慢，限制了其在大规模实验室的推广应用。
二、应用自动化仪器进行镜检筛选的原则与方法
       规范的尿有形成分显微镜检查是保证尿液分析结果质量的基础，原则上每份尿液标本都应采用这种方法检查，但目前化验室人员少，工作量大，每天有几十甚至几百份标本需要及时报告，使用人工镜检方法、又要求及时发出报告是困难的(此点对门、急诊患者尤为突出)，必须寻找一个简单、快速的方法进行过筛，即将完全正常的标本筛出，对异常的标本进行人工检查。因此，许多自动化仪器问世，用于镜检筛选并试图代替镜检。
       所谓筛选就是使用自动化仪器和显微镜检查2种方法对同一标本进行检测并将结果进行对比分析，经过足够量的正常、异常样本检查，统计分析找出内在联系，当显微镜检查结果在正常范围(白细胞在0~5个/HP、红细胞在0～3个/HP)时，根据自动化仪器所得结果制定筛选标准。在日常工作中，先用仪器检测，当仪器分析的结果达到制定的标准时，可视为白细胞、红细胞在正常范围内。仪器无“报警”表示仪器结果能客观反映尿有形成分状态，此时无需镜检。反之，需近一步做标准化镜检。如果l份标本经过干化学、镜检2种方法检查，干化学结果符合过筛标准，镜检结果在正常范围内，说明筛选是正确的；干化学结果不符合过筛标准，镜检结果也异常，也说明筛选是正确的。干化学结果异常，镜检结果正常视为假阳性；反之干化学结果正常，镜检结果异常视为假阴性。因此，合理的筛选标准的制定是正确使用仪器、保证结果质量的重要因素。目前国内外应用的筛选方法有以下3种。
       1．利用尿干化学检验结果进行镜检筛选：根据文献、多中心科研数据，中华医学会检验分会1995年制定的尿液干化学镜检筛选指南规定：“尿液干化学检查结果为白细胞、红细胞、亚硝酸盐、蛋白4项指标同时皆为阳性时(肾病患者除外)可视为尿内有形成分大致在正常范围内，可免除镜检”。但同时要求在使用这项镜检筛选方法时应注意：(1)肾科及泌尿科患者尿液不适合于干化学过筛显微镜检查。即无论干化学结果如何，均应做显微镜检查。(2)镜检用于结石、结晶、肿瘤患者的诊断依据或观察疗效时，不宜过筛。(3)尿液的外观(特别是颜色、浊度)与尿沉渣有一定相关关系，当尿液外观异常时，即使干化学结果符合筛选标准也应考虑是否显微镜检查。(4)干化学试带的质量、稳定性及质量控制与过筛的准确性密切相关。仪器的正常运转和试带质量是实验结果的基本保证。每个实验室使用过筛标准时，首先必须做对照观察(干化学试带与显微镜对比)，确认仪器试带的敏感性与特异性是否符合过筛标准的要求。
       干化学筛选简单易行、检验成本低、便于推广是其优点。筛选原则是宁可出现较多假阳性，不可出现假阴性，因为假阳性经复检后，还可更正报告。但较多假阳性会造成复检率增加，在短时间要进行大量标本检查仍然是很困难的。有时还会给临床诊断思路造成混乱。但另一方面，即便最严格的筛选也会出现假阴性造成漏诊。因此遇有疑问的筛选阴性病例时，要结合临床表现综合分析，决不可只看干化学结果，忽视镜检。笔者曾对6349份尿液标本做了镜检和干化学筛选2种方法的结果符合性分析[4-6]，如以干化学红细胞数在10个/ul 以下为阴性，则与镜检结果比较的假阳性率为30.90%，假阴性率为0.13%；如以干化学红细胞数在25个/ul 以下为阴性，则与镜检结果比较的假阳性率为13.80%，假阴性率为7.10%。这些不足都限制了镜检筛选方法的使用。
       2．尿液流式分析仪镜检筛选法：尿液流式分析仪是20世纪中期将流式细胞术用于尿液检查的“专用型”流式细胞仪。目前最新型号是UF-1000i。其应用的是半导体激光流式细胞/核酸荧光染色技术，对各种有形成分的细胞膜、细胞核、细胞质进行特异性的核酸荧光染色；具有独立的双检测通道(沉渣通道、细菌通道)，可排除标本采集过程中无法克服的杂菌对其他各有形成分检测的干扰，对要求进行细菌检测的样本可以进行细菌定量，提供尿路感染的筛查报告，提供临床微生物培养的证据；可定量报告参数12项、临床诊断信息3项、研究参数11项。包括：RBC、WBC、内皮细胞(EC)、管型(CAST)、细菌(BACT)、病理管型(P-CAST)、小圆细胞(SRC)、酵母菌(YLC)、结晶(CRYSTAL)、精子(SPERM)、黏液丝(MUCUS)、电导率
(COND)和红细胞形态学信患、尿电导率分级、尿路感染信息等。
       尿液流式方法规范，自动化程度高，可报告多项参数。但由于其基本原理仍是根据有形成分的大小进行非形态分析，对形态异常的成分，如形态异常的红细胞、白细胞，具有诊断意义的各类管型、肿瘤细胞，此时仪器“报警”提示仪器不能准确辨认细胞类型和计数。准确地说，其作用仍然是筛选，只不过其比干化学筛选法假阴性、假阳性减少了许多。但较高价格的仪器与试剂增加了检验的成本，不宜在标本量少的单位使用。
       3．尿液自动有形成分识别系统镜检过筛法：尿液有形成分自动识别系统(亦称机器视觉技术)根据数字成像原理，采用数字摄像机和显微镜光学系统采图，计算机对目标图像的特征参数进行数据分析，对计数池中的尿有形成分进行分类、计数，是近年来新兴的尿液有形成分分析技术。其方法简单、快速、自动化程度高。机器视觉技术包括：(1)视觉条件的调节(亮度、焦距、视阈的扫描)；(2)快速的视阈扫描发现目标，实现阴性筛选功能；(3)高倍跟踪定位放大采取目标更细微的特征参数；(4)根据目标特征参数建立的数据模型识别分类；(5)仪器可通过使用不断丰富数据库，因此，仪器使用时间越长，数据库越丰富，识别能力越强。根据仪器的原理和内存的数据库不同，对有形成分的识别能力也不同，有的甚至可识别形态有病理变化的有形成分。但当细胞形态变化超出仪器内置的模拟的数据库存时，仪器自动提示建议人工判别。因此，其仍不能完全代替镜检，只不过是仪器的档次不同，筛选的准确程度不同罢了。此种仪器最大的优点是当形态变化超出仪器的识别能力时，即可在仪器的屏幕上进行人工判别并可同时修改报告，而不需再重复繁琐的人工显微镜检验。另外，存储的病理成分还可打印在报告单上供临床医生参考，甚至还可用于远程会诊。这是一种正在发展中、很有前途的技术，相信不久的将来会延展到血细胞及其他细胞、粒子的分析。
三、关于尿液有形成分检查的几点拙见
       常规尿液分析是临床工作中最常用的实验诊断手段，尿液有形成分是其中重要的项目，有时具有直接的诊断意义，不管结果正常与否，其检验结果均应出现在检验报告单上。目前在许多医院实行的镜检筛选手段是因为患者多、标本量大、发报告急、检验人员少，做不到对每份标本镜检而采取的不得以而为之的方法，旨在通过筛选将有形成分“质”和“量”完全在正常范围以内的标本筛出，用充分的时间进行规范的人工镜检。从这种意义讲，镜检筛选不是取消镜检，而是为了更好的镜检。
       影响干化学反应的因素很多，尿液内许多化学物质或代谢的病理物质可干扰干化学反应引起“假阳性”、“假阴性”，使用干化学筛选法时要特别注意；还应注意由于细胞破坏造成的“假阳性”现象；所谓“假阳性”、“假阴性”是以显微镜检查为基础的。由于干化学是检测细胞胞浆内涵物来确定细胞的有无，在实际工作中可能遇到由于尿液在膀胱贮存时间过长，导致白细胞破坏，酯酶释放到尿液中，造成千化学阳性、镜检阴性的所谓“假阳性”现象。
       ISO15189文件明确指出：“当同样的检验应用不同程序或设备，或在不同地点进行，或以上各项均不同时，应有确切机制以验证在整个临床适用区间内检验结果的可比性”。不同仪器检测原理不同，同一标本用不同仪器计数结果可不同，甚至相差很大。同一医院如有几个不同实验室，使用的干化学分析仪、有形成分定量仪器所得结果必须是可比的，建议最好均使用同一型号的仪器。否则，使用不同仪器的实验室应建立自己的参考范围，显然，同一检测指标在同一医院出现几个参考范围是不利于临床工作的[7-8]。
       近年来，随着高新技术在医学检验领域的应用，许多先进的仪器为我们提供了新的指标，无疑促进了检验医学的发展。但不同类别、不同档次、不同诊断参数适用于不同规模、不同专科、不同性质的医院，在配置尿液检查仪器时，应根据实验室的实际情况，医院的规模，门、急诊量的大小，临床对检验的要求等因素来决定购买仪器的类型。
      尿液有形成分检查报告通常有2种形式，一种是以“个/HP”格式的半定量方法；另一种是以“个/ul ”格式的全定量方法。精确的定量报告有利于动态观察疾病的发展和治疗效果，多用于肾脏疾病的诊治。如临床需要或实验室条件允许，应尽量以定量方式报告。但使用人工法全定量检测时，费工、费时，应用仪器法成本高，增加患者经济负担。笔者认为除非特别需要，准确的半定量报告即可满足临床要求。
       以上是笔者近些年工作实践和实验研究中的几点拙见，抛砖引玉，供同道们参考。
参考文献
[1]丛玉隆．现代尿液分析技术与临床．北京：人民军医出版社，2007．
[2]丛玉隆，邓新立，马骏龙．WS/T229尿液物理学、化学及沉渣分析(中华人民共和国卫生行业标准)．中华人民共和国卫生部．2002．
[3]中华医学会检验分会血液体液学组．尿液沉渣检查标准化建议．中华检验医学杂志，2002，25：249-250．
[4]周建山，丛玉隆，宋国良．尿液分析仪测定尿红细胞与显微镜计数结果对比分析．陕西医学检验，1996，11增刊：150-151．
[5]宋国良，丛玉隆，周建山，等．Comber-10 Test M尿白细胞检测临床应用探讨．临床检验杂志，1996，14：44-45．
[6]丛玉隆，宋国良，周建山．干化学尿液分析与管型检查的关系研究．中华医学检验杂志，1997，20：138-140．
[7]马骏龙，陆玉静，黎晓辉，等．尿液红、白细胞定量不同方法的探讨．临床检验杂志，2006，24：348-350．
[8]丛玉隆，马骏龙，岳秀玲，等．中国健康人尿液显微镜检有形成分调查结果．临床检验杂志，2007，25：62-64．
                                                                                                            编辑：范伟伟